一种sRNA干扰体系在甲基菌中的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种sRNA干扰体系在甲基菌中的构建方法，首先利用转座酶将p15A质粒插入M.extorquens AM1和PA1中；sRNA干扰体系元件的扩增及载体构建；再进行目的基因的干扰及菌株筛选，最后荧光蛋白标记载体的构建及荧光蛋白基因的表达鉴定。本发明专利技术通过抑制竞争旁路代写途径的表达，优化代谢产物流，提高目标产物的表达水平。高效的基因表达技术对于次级代谢产物产量的优化提高有重要意义，可广泛应用于提高某种代谢产物产量研究。

Construction of a sRNA interference system in methylation bacteria

The invention discloses a construction method of sRNA interference system in methyl bacteria. First, p15A plasmid is inserted into M. extorquens AM1 and PA1 by transposase; amplification of sRNA interference system elements and construction of vector; interference of target genes and screening of strains; finally, construction of fluorescent protein marker vector and fluorescent protein gene. Expression and identification. The invention optimizes the metabolite flow and improves the expression level of the target product by inhibiting the expression of the competitive bypass proxy pathway. Efficient gene expression technology is of great significance for the optimization of secondary metabolites production, and can be widely used to improve the production of certain metabolites.

【技术实现步骤摘要】
一种sRNA干扰体系在甲基菌中的构建方法
本专利技术属于微生物
，涉及一种sRNA干扰体系在甲基菌中的构建方法。
技术介绍
Methylobacteriumextorquens(M.extorquens)AM1是一类甲基营养细菌，能够利用甲醇等一碳化合物作为唯一碳源合成高附加值的多碳有机物，具有很好的遗传代谢背景；但是其遗传操作手段相对单一，制约了外源生物合成途径的多元修饰改造。在已报导的外源基因高效表达的遗传操作手段中，常见的有核外高拷贝质粒表达的形式、以同源重组至染色体的方式、以及敲除竞争抑制途径的方式等，但是甲基营养菌由于其胞外多糖的干扰和核外复制质粒种类的限制，使得传统的基因工程操作技术过程与步骤繁琐耗时。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种sRNA干扰体系在甲基菌中的构建方法，本专利技术在AM1菌中引入sRNA(smallRNA，)干扰技术，对AM1中通用质粒pCM80质粒进行了不必要的基因片段的删减，优化该质粒。通过抑制竞争旁路代写途径的表达，优化代谢产物流，提高目标产物的表达水平。高效的基因表达技术对于次级代谢产物产量的优化提高有重要意义，可广泛应用于提高某种代谢产物产量研究。本专利技术所采用的技术方案是按照以下步骤进行：步骤1,利用转座酶将p15A质粒插入M.extorquensAM1中；步骤2，sRNA干扰体系元件的扩增及载体构建；步骤3，目的基因的干扰及菌株筛选。步骤4，荧光蛋白标记载体的构建及荧光蛋白基因的表达鉴定。进一步，步骤2中sRNA干扰体系元件的扩增及载体构建方法，首先分别选取了大肠杆菌E.coli、甲基菌M.extorquensAM1和PA1来源的三种不同的Hfq蛋白基因hfqE、hfqA、hfqP，分别与MicCscaffold相连，克隆到出发载体pCM80上，设计针对靶基因lacZ的24bp的sRNA片段连接到上述三个载体之上，最终构建成用于sRNA干扰的载体pCM80-zmic-hfqA、pCM80-zmic-hfqE、pCM80-zmic-hfqP。进一步，步骤3中目的基因的干扰及菌株筛选方法是将构建的sRNA载体转入带有LacZ基因的菌株AM1和PA1中，利用蓝白斑现象筛选目的菌株，并进行干扰效率的统计，筛选最优的sRNA干扰元件组合。进一步，步骤4中首先将不同来源的荧光蛋白基因克隆到pCM80载体上，转化至甲基营养菌中，再将其克隆到sRNA干扰载体中，完成构建过程。附图说明图1是重组菌株的差异示意图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明。专利技术材料：菌株：M.extorquensAM1、M.extorquensPA1、E.coli实验试剂：培养基、抗生素(Tet、Km)、X-Gal、无菌水、实验用品试剂盒、各种酶试剂等。实验器材：PCR仪、电转仪、紫外线分光光度计、高压灭菌锅、高分辨率的荧光成像显微镜仪器、恒温培养箱、摇床、水浴锅、超净工作台等。实验方法：(一)将外源的lacZ基因(编码β-半乳糖苷酶)插入M.extorquensAM1基因组中，获得的转化子作为宿主细胞M.extorquensAM1(lacZ)。该细胞在添加有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷)的培养基上显示蓝色性状，并以lacZ基因作为sRNA干扰的目标基因。(二)sRNA干扰体系元件的扩增及载体构建首先分别选取了大肠杆菌E.coli、甲基菌M.extorquensAM1和PA1来源的三种不同的Hfq蛋白基因hfqE、hfqA、hfqP，(蛋白序列见附录)分别与MicCscaffold相连，进一步克隆到出发载体pCM80上。进一步设计针对靶基因lacZ的24bp的sRNA片段，将之连接到上述三个载体之上，最终构建成用于sRNA干扰的载体pCM80-zmic-hfqA、pCM80-zmic-hfqE、pCM80-zmic-hfqP。以pCM80质粒为对照。三种不同来源的Hfq蛋白序列：>HfqAMAGERAQNLQDTFLNHVRKNKIPLTIFLVNGVKLQGVVTWFDNFCVLLRRDGHSQLVYKHAISTIMPGHPVQLFEPDETAPEKA>HfqEMAKGQSLQDPFLNALRRERVPVSIYLVNGIKLQGQIESFDQFVILLKNTVSQMVYKHAISTVVPSRPVSHHSNNAGGGTSSNYHHGSSAQNTSAQQDSEETE>HfqPMAGERAQNLQDTFLNHVRKNKIPLTIFLLNGVKLQGVVTWFGNFCVLLRRDGHSQLVYKPAISTIMPGHPVQLFEPDETAPEKA(三)sRNA干扰效率验证将构建的sRNA载体转入M.extorquensAM1(lacZ)宿主中，根据，利用蓝粉斑现象，并进行干扰效率的统计，筛选干扰效果最优的Hfq蛋白来源。通过实验与对照质粒pCM80，我们确定pCM80-zmic-hfqA质粒针对lacZ基因的干扰效率为56％、pCM80-zmic-hfqE的干扰效率为83％、pCM80-zmic-hfqP的干扰效率为21％。确定了在甲基菌中干扰效果最为理想的Hfq蛋白是来源于大肠杆菌的。实验结论：1.含有不同Hfq蛋白的三种sRNA干扰质粒转化宿主细胞后，在X-gal培养基上生长情况。图1为在添加X-gal的培养基上，宿主细胞M.extorquensAM1(lacZ)和导入了sRNA干扰体系的三个重组菌株的差异：从图1中看出，与对照质粒pCM80干扰对比，pCM80-zmic-hfqE转化后细胞大部分处于原始粉色状态，可见干扰效果最为明显，而pCM80-zmic-hfqP质粒转化后大部分细胞处于蓝色状态，干扰效果最差。2.三种质粒的干扰效率统计：通过大量的转化平板实验，我们统计每个板上蓝色与粉色克隆出现的数目，最终确定，三个质粒的干扰效率如下表1。表1质粒pCM80pCM80-zmic-hfqApCM80-zmic-hfqEpCM80-zmic-hfqP干扰效率056.2％±2.4％83.1％±3.7％21.4％±3.1％3.含有干扰质粒的菌株生长曲线测定：通过生长曲线的测定，我们发现干扰效果较为明显的菌株生长略微延迟，且pCM80-zmic-hfqA比pCM80-zmic-hfqE转化菌株生长延迟，而干扰效果不明显的pCM80-zmic-hfqP转化菌株生长与对照相比略快。从以上结果可以总结出，在干扰效果及菌株生长速率上，含有pCM80-zmic-hfqE干扰质粒的菌株占优势，大肠杆菌来源的Hfq蛋白优势且高效，其次是甲基菌株M.extorquensAM1来源的Hfq蛋白。本专利技术的优点还在于通过sRNA干扰体系在甲基菌中的构建，借助β—半乳糖苷酶目标靶基因指示检测，进行遗传操作体系效率验证，实现目标基因的高效表达和目标菌株的高通量筛选。现有技术中由于甲基营养菌胞外多糖的干扰和核外复制质粒种类的限制，使得现有的基因工程操作技术过程与步骤繁琐耗时，本专利技术引入smallRNA(sRNA)高通量干扰技术，通过干扰某些旁路基因的表达而提高目的基因表达水平，操作简便而高效。以上所述仅是对本专利技术的较佳实施方式而已，并非对本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种sRNA干扰体系在甲基菌中的构建方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1,利用转座酶将p15A质粒插入M.extorquens AM1中；步骤2，sRNA干扰体系元件的扩增及载体构建；步骤3，目的基因的干扰及菌株筛选。步骤4，荧光蛋白标记载体的构建及荧光蛋白基因的表达鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种sRNA干扰体系在甲基菌中的构建方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1,利用转座酶将p15A质粒插入M.extorquensAM1中；步骤2，sRNA干扰体系元件的扩增及载体构建；步骤3，目的基因的干扰及菌株筛选。步骤4，荧光蛋白标记载体的构建及荧光蛋白基因的表达鉴定。2.按照权利要求1所述一种sRNA干扰体系在甲基菌中的构建方法，其特征在于：所述步骤2中sRNA干扰体系元件的扩增及载体构建方法，首先分别选取了大肠杆菌E.coli、甲基菌M.extorquensAM1和PA1来源的三种不同的Hfq蛋白基因hfqE、hfqA、hfqP，分别与MicCscaffold相连，克隆到出发载体pCM80上，设计针对靶基因lacZ的2...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱丽萍，杨松，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37