一种表达抗HIV双特异性抗体的微环DNA载体及其制备方法和应用技术

本申请涉及一种表达抗HIV双特异性抗体的微环DNA载体及其制备方法和应用。具体涉及一种用于在体内表达抗HIV双特异性抗体的微环DNA载体。所述抗HIV双特异性抗体结合HIV感染细胞，还能中和游离的HIV病毒。所述微环DNA载体、双特异性抗体用于预防或治疗艾滋病或HIV感染等病症。

【技术实现步骤摘要】
一种表达抗HIV双特异性抗体的微环DNA载体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种重组基因载体，更具体为一种用于在体内表达抗HIV双特异性抗体的微环DNA载体(MC.anti-HIV.BsAb)。
技术介绍
人免疫缺陷病毒(HIV)感染严重威胁人类健康。HIV病毒感染细胞后，病毒基因组会整合进细胞基因组，形成原病毒(Protovirus)，作为病毒持续复制的模板。现有抗病毒治疗手段能抑制病毒复制，控制病毒载量，然而却无法彻底消灭带原病毒的细胞，从而清除原病毒库。只有清除受感染的细胞，才能实现清除原病毒库之目的。研究表明，部分HIV感染者机体免疫系统能产生广谱的HIV中和抗体，既能清除游离的病毒颗粒，也能通过ADCC作用清除受感染的细胞(如：CD4+细胞等)。但是ADCC介导的细胞杀伤作用有限，无法清除所有的感染细胞。有证据表明，通过同时连接靶细胞和效应细胞(如：CD3+T细胞或CD16+NK细胞)，双特异性抗体可介导效应细胞对靶细胞的高效杀伤作用，比ADCC介导的杀伤效果强成千上万倍，特别适合于抗HIV治疗。此外，HIV处于隐匿状态时，病毒抗原不表达或处于极低表达水平，机体免疫和药物无法起作用。而CD3抗体对T细胞有激活作用，处于激活状态的T细胞转录活性增加，会促进靶细胞蛋白(包括整合于细胞基因组的病毒抗原)表达，使得双特异性抗体能够靶向作用于这些隐匿的感染细胞。与该专利技术最接近的技术是利用AAV载体表达HIV中和抗体AAV-anti-HIV(WO2012115980)，或者在体外表达纯化HIV双特异性抗体蛋白(WO2016054053)。然而，现有的AAV表达抗体技术存在缺点，包括成本高昂、安全性隐患。具体包括：(a)AAV病毒载体的包装、纯化过程复杂，需要大量细胞培养，耗时耗力；(b)AAV病毒的保存、运输等过程需要低温环境，造成成本上升及使用不便；(c)AAV病毒外壳容易激起强烈的免疫反应，而且载体中携带的DNA序列随机插入容易导致基因突变，甚至致癌风险。同样的，通过细胞培养在体外表达纯化HIV抗体的缺点主要是成本高昂，使用不便。具体包括：(a)抗体体外表达纯化工艺复杂，花费巨大；(b)蛋白保存、运输通常需要低温环境，要求较苛刻；(c)抗体使用需通过静脉或皮下注射，半衰期有限、需长期使用，加大了患者负担。本专利技术旨在利用重组基因载体，尤其是微环DNA载体在体内表达抗HIV双特异性抗体(MC.anti-HIV.BsAb)，用于预防或治疗艾滋病，清除HIV感染。
技术实现思路
本专利技术涉及一种用于在体内表达抗HIV双特异性抗体的重组基因载体(尤其是微环DNA载体MC.anti-HIV.BsAb)，起到清除HIV感染细胞的作用。由于本专利技术的抗体抗HIV的部分来源于广泛中和抗体，因此表达的抗HIV双特异性抗体也能起到中和游离HIV病毒的作用。本专利技术提供了一种表达抗HIV双特异性抗体的重组基因载体，所述双特异性抗体包括与HIV感染细胞特异性结合的第一抗原结合结构域，和与效应细胞特异性结合的第二抗原结合结构域；优选的，所述双特异性抗体还能中和游离的HIV病毒。在一个实施方案中，优选的，所述重组基因载体选自非病毒基因载体；更优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体。在一个实施方案中，所述效应细胞包括T细胞或NK细胞。优选的，所述第二抗原结合结构域特异性结合选自以下的作用靶点：CD3、CD28、4-1BB、OX40、TCR、CD16、CD56、NKG2D、NCR和其它。在一个实施方案中，所述重组基因载体为重组表达载体，选自原核表达载体或真核表达载体；优选真核表达载体；更优选用于哺乳动物细胞真核表达的重组表达载体。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的第一抗原结合结构域包含：如SEQIDNO:1所示氨基酸序列的重链可变区，和如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的轻链可变区；以及，所述双特异性抗体的第二抗原结合结构域包含：如SEQIDNO:3所示氨基酸序列的重链可变区，和如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，所述第一抗原结合结构域包含的重链可变区具有与SEQIDNO:1所示序列至少具有90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，包含的轻链可变区具有与SEQIDNO:2所示序列至少具有90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述第二抗原结合结构域包含的重链可变区具有与SEQIDNO:3所示序列至少具有90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，包含的轻链可变区具有与SEQIDNO:4所示序列至少具有90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。本专利技术提供了一种表达抗HIV双特异性抗体的重组基因载体，所述重组基因载体包含所述双特异性抗体的编码基因。在一个实施方案中，所述重组基因载体中所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。在一个实施方案中，所述重组基因载体中所述编码基因具有与SEQIDNO:5所示序列至少具有90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列。本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述编码基因序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。本专利技术提供了一种由之前实施方案中所述的重组基因载体所表达的双特异性抗体。优选的，所述重组基因载体选自非病毒基因载体；更优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体。本专利技术提供了一种之前实施方案中所述的重组基因载体的制备方法，包括如下步骤：(1)获取HIV中和抗体及其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列；(2)获取识别效应细胞的抗体及其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列；(3)构建表达抗HIV双特异性抗体的重组基因载体；任选的，(4)在体内外鉴定所述双特异性抗体的表达水平,并检测其对HIV感染细胞的清除作用。在一个实施方案中，在所述制备方法的所述步骤(1)中，(a)从现有技术中获取HIV中和抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，或者(b)分离HIV抗体阳性患者血清中的HIV特异性中和单克隆抗体，随后对所述抗体的可变区测序；在所述步骤(2)中，从现有技术中获取识别效应细胞的抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。在一个实施方案中，优选的，所述效应细胞包括T细胞或NK细胞；优选的，所述识别效应细胞的抗体特异性结合选自以下的作用靶点：CD3、CD28、4-1BB、OX40、TCR、CD16、CD56、NKG2D、NCR和其它。本专利技术提供了一种宿主细胞，包含之前实施方案中所述的重组基因载体，或由之前实施方案中所述的制备方法所得到的重组基因载体。在一个实施方案中，所述宿主细胞包括细菌细胞、酵母菌细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞。本专利技术提供了一种之前实施方案中所述的双特异性抗体的制备方法，具体步骤包括：(1)构建所述重组基因载体；(2)将所述重组基因载体导入宿主细胞；(3)在适合表达的条件下，培养宿主细胞，表达，分离纯化，获得所述双特异性抗体。本专利技术提供了一种药物组合物，包含之前实施方案中所述的重组基因载体或之前实施方案中所述的双特异性抗体，以及药学上可接受的载体。在一个实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达抗HIV双特异性抗体的重组基因载体，其特征在于，所述双特异性抗体包括与HIV感染细胞特异性结合的第一抗原结合结构域，和与效应细胞特异性结合的第二抗原结合结构域；优选的，所述重组基因载体选自非病毒基因载体；更优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体；再优选的，所述双特异性抗体还能中和游离的HIV病毒；更优选的，所述效应细胞包括T细胞或NK细胞；最优选的，所述第二抗原结合结构域特异性结合选自以下的作用靶点：CD3、CD28、4‑1BB、OX40、TCR、CD16、CD56、NKG2D、NCR和其它。

【技术特征摘要】
1.一种表达抗HIV双特异性抗体的重组基因载体，其特征在于，所述双特异性抗体包括与HIV感染细胞特异性结合的第一抗原结合结构域，和与效应细胞特异性结合的第二抗原结合结构域；优选的，所述重组基因载体选自非病毒基因载体；更优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体；再优选的，所述双特异性抗体还能中和游离的HIV病毒；更优选的，所述效应细胞包括T细胞或NK细胞；最优选的，所述第二抗原结合结构域特异性结合选自以下的作用靶点：CD3、CD28、4-1BB、OX40、TCR、CD16、CD56、NKG2D、NCR和其它。2.如权利要求1所述的重组基因载体，其特征在于，所述第一抗原结合结构域包含：如SEQIDNO:1所示氨基酸序列的重链可变区，和如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的轻链可变区；以及，所述第二抗原结合结构域包含：如SEQIDNO:3所示氨基酸序列的重链可变区，和如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的轻链可变区。3.如权利要求1或2所述的重组基因载体，其特征在于，所述重组基因载体包含所述双特异性抗体的编码基因。4.如权利要求3所述的重组基因载体，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。5.如权利要求1-4中任一项所述的重组基因载体所表达的双特异性抗体。6.如权利要求中1-4任一项所述的重组基因载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)获取HIV中和抗体及其重链可变...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢亦武，
申请(专利权)人：深圳新诺微环生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44