本发明专利技术涉及靶向GD2的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明专利技术提供一种多核苷酸序列，选自：(1)含有依次连接的抗GD2单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明专利技术还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。
【技术实现步骤摘要】
靶向GD2的嵌合抗原受体及其用途
本专利技术属于细胞治疗领域，具体涉及靶向鼠源GD2的嵌合抗原受体及其用途。
技术介绍
嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。随着嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)技术的不断发展，目前CAR-T主要可划分为四代。第一代CAR-T细胞由胞外结合区-单链抗体(single-chainfragmentvariable,scFV)、跨膜区(transmembraneregion,TM)和胞内信号区——免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)组成，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD3ζ。第一代CAR虽然能够看到一些特异性的细胞毒性，但2006年对其进行临床试验总结的时候却发现疗效差强人意。究其原因是因为第一代CAR-T细胞在病人体内很快就会耗竭，其持久性(persistence)很差，以至于CAR-T细胞还没有来得及接触到大量的肿瘤细胞时就已经凋亡了该种CAR-T细胞可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，但其在体内的存活期较短不能激发持久的抗肿瘤效应。[CancerRes.2007,67(22):11029-11036.]第二代CAR-T细胞优化CAR设计中T细胞活化信号区仍然是研究的热点。T细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号，由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第二信号为协同刺激信号。早在1998年就出现了第二代CAR(JImmunol.1998；161(6):2791-7.)。第2代CAR在胞内信号肽区添加了一个协同刺激分子，即把协同刺激信号组装到CAR里面，能够更好的为CAR-T细胞提供活化信号，这样CAR识别肿瘤细胞后能够同时活化协同刺激分子和胞内信号，实现双重活化，能明显提高T细胞增殖分泌能力和抗肿瘤效应。第一个被详细研究的T细胞共刺激信号受体是CD28，它能够与靶细胞表面的B7家族成员结合。CD28的共刺激能够促进T细胞的增殖，IL-2的合成和表达以及增强T细胞抵抗凋亡的能力。随后又出现了CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等共刺激分子，以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长T细胞存活时间等。这样的第二代CAR在随后的临床试验中产生了意想不到的效果，从2010年起基于第二代CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于复发性、难治性的ALL病人，其完全缓解率高达90％以上。第三代CAR信号肽区整合2个以上的协同刺激分子，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，T细胞杀伤肿瘤细胞的能力更加显著，即新一代的CAR可获得更强的抗肿瘤应答(MolTher.2005,12(5):933-941.)。最典型的就是UPenCarlJune在CD28刺激因子的作用下又加了一个CD137(4-1BB)的刺激因子。第四代的CAR-T细胞则加入了细胞因子或共刺激配体，例如四代CAR可以产生IL-12,其能够调节免疫微环境-增加T细胞的激活，同时激活固有免疫细胞使其发挥作用来清除靶抗原阴性的癌细胞，从而达到双向调节的作用。[ExpertOpinBiolTher.2015；15(8):1145-54.]。神经节苷脂GD2是神经系统细胞膜的重要组成部分，在细胞膜上充当重要的调节细胞膜内蛋白质的功能。神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)为节后交感神经系统胚胎性肿瘤，是儿童最常见的颅外实体恶性肿瘤。NB发病早、恶性程度高、预后差，诱导化疗后仍有10％～20％的患儿发展为难治性NB。尽管手术切除、放射治疗、化疗以及造血干细胞移植等多重疗法介入，NB患儿总体生存率已有所提高，但高危患儿临床预后仍不佳，因此急需寻找新的治疗方法以降低该类患儿的病死率。神经节苷脂GD2属于神经节苷脂鞘脂类，在NB、尤因家族肿瘤、骨肉瘤等实体瘤中过表达，而在其他正常组织中限制性表达，理论上是针对NB免疫治疗的理想靶点。本专利技术专利引入鼠源针对GD2靶点的CAR-T细胞在体内发挥作用。为临床实验和临床治疗奠定良好的基础。
技术实现思路
本专利技术第一方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)含有依次连接的抗GD2单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列的多核苷酸序列；和在一个或多个实施方案中，在所述抗GD2单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQIDNO:1第1-63位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗GD2抗体的轻链可变区编码序列如SEQIDNO:1第64-402位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗GD2抗体的重链可变区编码序列如SEQIDNO:1第448-786位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD8α铰链区和CD8跨膜区的编码序列如SEQIDNO:1第787-993位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人41BB胞内区的编码序列如SEQIDNO:1第994-1137位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQIDNO:1第1138-1470位核苷酸序列所示。本专利技术第二方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：(1)含有依次连接的抗GD2单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白的编码序列；和(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白；优选地，所述抗GD2单克隆抗体为14G2A。在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列在所述抗GD2单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2第1-21位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗GD2单链抗体轻链的氨基酸序列如SEQIDNO:2第22-134位氨基酸所示。在一本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)含有依次连接的抗GD2单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)含有依次连接的抗GD2单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。2.如权利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列在所述抗GD2单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列，优选地，所述信号肽的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1-63位多核苷酸所示；和/或所述抗GD2单链抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第64-402位多核苷酸所示；和/或所述抗GD2单链抗体的重链可变区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第448-786位多核苷酸所示；和/或所述人CD8α铰链区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第787-927位多核苷酸所示；和/或所述人CD8跨膜区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第928-993位多核苷酸所示；和/或所述人41BB胞内区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第994-1137位多核苷酸所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1138-1470位多核苷酸所示。3.如权利要求2所述的氨基酸序列，其特征在于，在所述抗GD2单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQIDNO:2第1-21位氨基酸序列所示；和/或所述抗GD2单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQIDNO:2第22-134位氨基酸序列所示；和/或所述抗GD2单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQIDNO:2第150-262位氨基酸序列所示；和/或所述人CD8α铰链区的编码序列如SEQIDNO:2第263-309位氨基酸序列所示；和/或所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQIDNO:2第310-331位氨基酸序列所示；和/或所述人41BB胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第332-379位氨基酸序列所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第380-490位氨基酸序列所示。4.一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：(1)含有依次连接的抗GD2单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白编码序列；和(2)在(1)限定...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘雅容，金涛，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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