靶向mesothelin的嵌合抗原受体并联合表达IL-15的方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体mMesothelin scFv‑CD8H&TM‑CD28‑41BB‑CD3ζ‑mbIL15及其用途，该嵌合抗原受体由抗鼠Mesothelin单克隆抗体(克隆号：SS1)的轻链和重链可变区(Mesothelin scFv)、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区和人CD28、41BB胞内区、以及人CD3ζ胞内区和IL15+IL15Rα结构串联构成。本发明专利技术制备的Meso‑mbIL15 CART细胞对特异性肿瘤细胞具强烈的杀伤功能，本发明专利技术制备的Meso‑mbIL15 CART细胞具有很好的增殖能力。

【技术实现步骤摘要】
靶向mesothelin的嵌合抗原受体并联合表达IL-15的方法和用途
本专利技术属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向间皮素的嵌合抗原受体及其用途。
技术介绍
胰腺癌(PancreaticCarcinoma)是临床上常见的消化系统恶性肿瘤，多见于50岁以上的人群。其发病率有明显的地区差异，近年来发病率呈逐渐上升趋势，在欧美国家已是第4位常见的恶性肿瘤，居消化道癌症死因的第2位，仅次于大肠癌,其发病隐匿，早期症状无特异性，手术切除率低。在肿瘤发生发展的进程中，很多基因的活化及其产物的表达起到了重要的作用，其内在确切的分子机制尚不完全明确，随着现代影像及内镜技术的飞速发展，对一些症状体征及影像表现较为明显的胰腺癌，明确诊断己没有太大困难，但此时大多己失去最佳手术时机，而对于一些早期患者诊断较难。因此寻求新的治疗手段，对于胰腺癌的治疗是当务之急。在肿瘤的浸润转移过程的研究方面，间皮素(Mesothelin)也是当前研究的热点。1996年Chang等利用宫颈癌HeLa细胞克隆出单克隆抗体识别的抗原，研究发现该抗原存在于正常间皮细胞，故命名为Mesothelin。肿瘤患者术后生存率低预后差的主要原因与它的浸润转移有关，肿瘤的浸润转移机制研究是目前的热点和难点。Mesothelin基因编码一种69kDa的前体蛋白，经加工形成一个40kDa的膜结合蛋白(即Mesothelin)和一个3lkDa称之为巨核细胞促进因子MPF的脱落片断。间皮素高表达于多种肿瘤组织中，卵巢癌患者血清中的MesothelinmRNA和蛋白质水平高表达，组织切片染色显示非粘蛋白卵巢癌中有66％呈间皮素阳性；在胸膜间皮瘤的检测中发现，15例确诊为上皮性间皮瘤的病例全都呈阳性，4例肉瘤性间皮瘤全为阴性；Argani等研究报道，切除的原发性胰腺癌中，免疫组化法检测表明60例有54例强阳性，而周围正常胰腺组织则无Mesothelin反应活性；在其他实体肿瘤分析中，官颈、头、颈、阴道、肺及食管的鳞癌冰冻切片中均可发现间皮素免疫活性，肺腺癌、子宫内膜癌、交界性滑膜肉瘤及结缔组织增生性小圆细胞肿瘤有少量间皮素表达，在乳腺癌，甲状腺癌、肾细胞癌、膀胱移细胞癌、黑色素癌及肝癌中仅有少许或没有Mesothelin表达。Mesothelin的生物学功能尚未明确。Pastan等构建了一种Mesothelin基因突变小鼠，这些基因突变小鼠与同胞的野生型小鼠生长和繁殖相同，并且二者的血小板计数没有统计学差异；有研究显示Mesothelin与CA125结合能介导细胞粘附，由此研究者们也认为CA125和Mesothelin在卵巢癌的转移扩散中可能起重要作用；另外，有研究亦表明，Mesothelin基因的表达受到Wnt等重要信号途径的调节，如在卵巢癌和胰腺癌中，Wnt信号转导途径持续激活促使Mesothelin表达增加。虽然。Mesothelin的功能及其致癌作用仍有待于进一步明确，但其在正常组织中的分布有限而在某些肿瘤组织高度表达的特征，因而Mesothelin可作为肿瘤特异性抗体治疗的靶向。嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。目前在ClinicalTrials.gov注册的抗MesothelinCAR-T细胞治疗临床试验有10项，主要针对胰腺癌、卵巢癌、胸膜瘤、肺癌以及乳腺癌等恶性肿瘤。在宾夕法尼亚大学开展的I期临床研究中，病人都是在接受过一线治疗后病情进一步发展，并且肿瘤组织表达Mesothelin，他们接受了瞬转CARmRNA的T细胞治疗。这种Mesothelin特异性的二代CAR具有CD3ξ和4-1BB共刺激因子结构域。这些Mesothelin特异性的CART存活期短，在两位病人中表现出了抗肿瘤作用，可见Mesothelin能够作为CART细胞识别的抗原，并且瞬转mRNA的方式也是可行的。另一项宾夕法尼亚大学开展的I期临床研究使用的是慢病毒转染的Mesothelin特异性CAR。这项开始于2014年7月的研究是针对耐化疗的恶性胰腺癌、上皮性卵巢癌和恶性上皮胸膜间皮瘤。在6位病人的早期研究结果中，4位病人在CART细胞输注28天后病情稳定。CART细胞输注没有引起急性副反应，并且相比mRNA瞬转，慢病毒转染构建的CART细胞的持续性得到提升。白细胞介素15(interleukin15，IL-15)是1994年发现的一种细胞因子，是由114个氨基酸组成的14-15KD大小的糖蛋白，属于四螺旋束细胞因子家族中的一员。IL-15在结构上与白细胞介素2(interleukin2，IL-2)有同源性，受体由具有高亲和力的IL-15受体a链、IL-2/15受体β链以及公共链γ链组成。因此IL-15具有一些和IL-2相近的功能，比如刺激T细胞活化和增殖，增强NK细胞杀伤活性并促进B细胞产生免疫球蛋白。最近研究发现IL-15在NK细胞、NKT细胞以及肠上皮细胞的分化、增殖、活化过程中发挥了重要作用，IL-15与IL-17对CD8记忆性T细胞的稳态调节非常重要。研究还证明IL-15通过一种特殊的“反递呈”机制来调控CD8记忆性T细胞的增殖和NK细胞的生存周期，即一种表达IL-15α链受体的细胞能够将IL-15递呈给表达IL-15B链和γ链的细胞。更多的研究表明IL-15是一种有广泛生物学功能的功能强大的细胞因子，除了对免疫系统有着重要的调节作用，在非免疫系统中也同样重要，比如对骨骼肌合成代谢也发挥重要调节作用。本专利技术对构建的靶向Mesothelin的三代CAR,共刺激因子为41BB和CD28，本专利技术对此CAR进行了修饰即引入了IL15结构，IL15是功能强大的细胞因子，对免疫系统有着重要的调节作用，有了此结构的加入，构建的CAR-T细胞将会有更强有力的功能。随着CAR-T细胞治疗经验的积累和不断完善，其在实体肿瘤中的应用越来越受到各界关注。在此环境下，我们要加快步伐，利用自身已有的工作基础、研发团队、医疗团队申请开展临床试验，推动CAR-T细胞治疗在实体瘤的道路上快速前进。
技术实现思路
本专利技术第一方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)含有依次连接的抗间皮素单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人CD28胞内区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、和IL15结构编码序列的多核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)含有依次连接的抗间皮素单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人CD28胞内区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、和IL15+IL15Rα结构编码序列的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)含有依次连接的抗间皮素单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人CD28胞内区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、和IL15+IL15Rα结构编码序列的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。2.如权利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列在所述抗间皮素单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列，优选地，所述信号肽的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1-66位多核苷酸所示；和/或所述抗间皮素单链抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第67-384位多核苷酸所示；和/或所述抗间皮素单链抗体的重链可变区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第421-777位多核苷酸所示；和/或所述人CD8α铰链区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第778-918位多核苷酸所示；和/或所述人CD8跨膜区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第919-984位多核苷酸所示；和/或所述人CD28胞内区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第985-1107位多核苷酸所示；和/或所述人41BB胞内区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1108-1251位多核苷酸所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1252-1584位多核苷酸所示；和/或所述人IL-15与IL15Rα的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1717-2848位多核苷酸所示。3.如权利要求2所述的氨基酸序列，其特征在于，在所述抗间皮素单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQIDNO:2第1-22位氨基酸序列所示；和/或所述抗间皮素单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQIDNO:2第23-128位氨基酸序列所示；和/或所述抗间皮素单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQIDNO:2第141-259位氨基酸序列所示；和/或所述人CD8α铰链区的编码序列如SEQIDNO:2第260-306位氨基酸序列所示；和/或所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQIDNO:2第307-328位氨基酸序列所示；和/或所述人CD28胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第329-369位氨基酸序列所示；和/或所述人41BB胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第370-417位氨基酸序列所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第418-528位氨基酸序列所示；和/或所述人IL-15与IL15Rα的片段的编码序列如SEQIDNO:2第573-949位氨基酸序列所示。4.一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：(1)含有依次连接的抗间皮素单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、人CD28胞内区、人41BB胞内区和...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄飞，金涛，王海鹰，何凤，史子啸，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31