异质双聚体型血管内皮生长因子及其应用制造技术

本发明专利技术关于一种融合蛋白，包含：(i)第一血管内皮生长因子同功异形体，与(ii)第二血管内皮生长因子同功异形体，及(iii)介于该第一同功异形体与该第二同功异形体间的双聚化功能域，其中该第一同功异形体及该第二同功异形体选自VEGF121及VEGF165。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】异质双聚体型血管内皮生长因子及其应用引用相关申请文件本专利技术主张美国临时申请第62/262,630号(申请日为2015年12月3日)的优先权，其完整内文以引用方式纳入本说明书为参考文献。
技术介绍
血管生成是肿瘤发展过程中一个重要的限速过程(rate-limitingprocess)，其通过将平衡倾向于促血管新生因子(proangiogenicfactors)，而驱动血管生长而被诱导发生。处在微环境中的癌细胞需倚赖血管生成来供给氧及营养物。因此，靶定血管生成途径的药剂已被研发作为具潜力的癌症药物。最初的努力主要集中于靶定内皮与肿瘤衍生的血管内皮生长因子A(VEGF-A)/VEGFR信号传导。已设计出数种不同的策略，用以抑制此种信号传导，作为单一疗法或辅助疗法，例如VEGFR信号传导的小分子抑制剂、VEGF-陷阱、抗-VEGFR抗体及抗-VEGF-A单株抗体贝伐单抗(Bevacizumab)(癌思停，Avastin)，为第一种在2004年被美国FDA批准的VEGF-A标靶抗体。但是，有许多患者对抗血管生成药物没有反应，或很快地对其产生抗性。肿瘤可通过适应性反应(adaptiveresponse)，例如增量调节替代的促血管新生信号传导、选择正常的肿瘤周围血管、通过招集免疫细胞与骨髓衍生的促血管新生细胞抑制免疫监控及活化侵袭性表现型，而对抗血管生成药物产生抗性。此等适应性反应是通过，因肿瘤血管修剪及广泛抑制血管生成所引起的肿瘤内缺氧而被诱导发生。有效抑制VEGF-A/VEGFR信号传导，并同时减轻对抗血管生成治疗的抗性，仍然是一项主要的挑战。
技术实现思路
于是，本专利技术的一方面关于一种融合蛋白，含有(i)第一血管内皮生长因子(VEGF)同功异形体，(ii)第二VEGF同功异形体，及(iii)介于该第一同功异形体与该第二同功异形体间的双聚化功能域。所述第一同功异形体及第二同功异形体选自VEGF121及VEGF165。VEGF121可具有与SEQIDNO:2达至少80％(例如，至少99％、98％、97％、96％、95％、90％或85％)序列同一性的胺基酸序列。VEGF165可具有与SEQIDNO:4达至少80％(例如，至少99％、98％、97％、96％、95％、90％或85％)序列同一性的胺基酸序列。于一项具体实施状态中，所述的双聚化功能域含有两个Fc区域，及一介于该二Fc区域间的连结肽。所述的连结肽可为一由15至30个胺基酸组成的可挠性连结肽。例如，所述的连结肽可为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，n为3、4、5或6。于一项具体实施状态中，所述的融合蛋白包括(从N-端至C-端的方向)VEGF121、所述二Fc区域其中之一、所述的连结肽、所述二Fc区域其中另一个及VEGF165。于一项具体实施状态中，所述的融合蛋白包括(从N-端至C-端的方向)VEGF165、所述二Fc区域其中之一、所述的连结肽、所述二Fc区域其中另一个及VEGF121。所述的融合蛋白可具有与SEQIDNO:11达至少80％序列同一性的胺基酸序列。于另一方面，本专利技术关于一种核酸分子，包含一编码本专利技术所述融合蛋白的核酸序列。于一项具体实施状态，所述的核酸序列为编码一与SEQIDNO:11达至少80％(例如，至少99％、98％、97％、96％、95％、90％或85％)序列同一性的胺基酸序列。于又另一方面，本专利技术关于一种医药组成物，包含所述的融合蛋白及医药上可接受的载体。所述的医药组成物可用于治疗癌症，或抑制有需要个体中的血管生成。于以下的实施方式及参照的附图，将详细描述本专利技术的一项或多项具体实施状态。该等具体实施状态的其它特色、标的及优点，将由下列叙述说明及附图，以及专利保护范围彰显出来。附图说明图1为所述血管内皮生长因子(VEGF)同功异形体的示意图。图2为一种VEGF121-VEGF165融合蛋白的示意图。图3为一组图显示所述VEGF121-VEGF165蛋白对于细胞增生的影响。总共1×104个3B-11细胞(A)及HCT-15细胞(B)，于VEGF165(222pM)存在下以该融合蛋白(42、83、125pM)处理。细胞增生为以CCK-8套组进行测定(t-test,*P<0.05,**P<0.01,n＝3)。1:对照组；2:VEGF165；3:VEGF165+VEGF121-VEGF165(42pM)；4:VEGF165+VEGF121-VEGF165(83pM)；5:VEGF165+VEGF121-VEGF165(125pM)。图4为一组图显示所述VEGF121-VEGF165蛋白对于血管形成的影响。(A)3B-11(8×105)细胞接种于Matrigel，并于VEGF165(222pM)存在下以VEGF121-VEGF165(42、83、125pM)处理。管形成是经由在100×放大倍数下随机选择的视野中计数连接的细胞来定量。1:对照组；2:VEGF165；3:VEGF165+VEGF121-VEGF165(42pM)；4:VEGF165+VEGF121-VEGF165(83pM)；5:VEGF165+VEGF121-VEGF165(125pM)。(B)将VEGF121-VEGF165质体转感染至3B-11细胞中。使用3B-11细胞完成管形成分析。数据以平均值表示，基于三次独立实验。1:对照组；2:VEGF165(222pM)；3:VEGF121-VEGF165质体。*P<0.05，**P<0.01，***p<0.001。图5为显示VEGF121-VEGF165蛋白对于3B-11细胞移行的影响。将VEGF121-VEGF165质体转感染至3B-11细胞中。使用经转染的3B-11细胞测定细胞移行。3B-11细胞的细胞移行能力在VEGF165(222pM)存在时增强，但受到VEGF121-VEGF165质体的存在抑制。图6为一组图显示所述VEGF121-VEGF165蛋白对于HCT-15细胞移行的影响。(A)HCT-15细胞接种于TranswellTM可通透嵌件中，并以VEGF121-VEGF165蛋白(42、83、125pM)或于VEGF165(222pM)存在下进行处理。于TranswellTM可通透嵌件中分析间隙之间的距离。以未经处理的HCT-15细胞为对照组。1:对照组；2:VEGF165；3:VEGF165+VEGF121-VEGF165(42pM)；4:VEGF165+VEGF121-VEGF165(83pM)；5:VEGF165+VEGF121-VEGF165(125pM)。(B)将VEGF121-VEGF165质体转感染至HCT-15细胞中。使用经转染的HCT-15细胞测定细胞移行。HCT-15细胞的细胞移行能力在VEGF165(222pM)存在时增强，但受到VEGF121-VEGF165质体的存在抑制。t-检定,*P<0.05，**P<0.01，***p<0.001,n＝3。图7显示VEGF121-VEGF165蛋白对于细胞侵袭性的影响。将HCT-15细胞于VEGF165(222pM)存在下以不同浓度的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白质，其特征在于，包含：第一血管内皮生长因子(VEGF)同功异形体，第二VEGF同功异形体，及介于该第一同功异形体与该第二同功异形体间的双聚化功能域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.03 US 62/262,6301.一种融合蛋白质，其特征在于，包含：第一血管内皮生长因子(VEGF)同功异形体，第二VEGF同功异形体，及介于该第一同功异形体与该第二同功异形体间的双聚化功能域。2.如权利要求1所述的融合蛋白质，其特征在于，该双聚化功能域含有两个Fc区域。3.如权利要求2所述的融合蛋白质，其特征在于，进一步包含一介于该二Fc区域间的连结肽。4.如权利要求3所述的融合蛋白质，其特征在于，该融合蛋白质包含(从N-端至C-端的方向)VEGF121、该二Fc区域其中之一、该连结肽、该二Fc区域其中另一个及VEGF165。5.如权利要求3所述的融合蛋白质，其特征在于，该融合蛋白质包含从N-端至C-端的方向的VEGF165、该二Fc区域其中之一、该连结肽、该二Fc区域其中另一个及VEGF121。6.如权利要求3-5中任一项所述的融合蛋白质，其特征在于，该连结肽为一由15至30个胺基酸组成的可挠性连结肽。7.如权利要求6所述的融合蛋白质，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：李岳伦，蔡瑞玲，
申请(专利权)人：财团法人卫生研究院，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71