一种基于人铁蛋白的纳米酶及其制备方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体公开了一种基于人铁蛋白的纳米酶及其制备方法。所述制备方法以人铁蛋白为融合伴侣，将目标酶置于其N端进行融合表达，在目标酶与人铁蛋白之间插入连接肽。本发明专利技术所述制备方法能够显著提高目标酶对底物的催化活性，且使酶对温度及pH有更强的耐受性。该制备方法不仅限于人铁蛋白与甲基对硫磷水解酶和大肠杆菌碱性磷酸酶的融合表达，还适用于人铁蛋白与多种酶的融合表达，用来改良目标酶的特性，在科学研究和应用基础研究中具有较高的研究价值和科学意义。

A nano enzyme based on human ferritin and its preparation method

The invention belongs to the field of genetic engineering technology, and specifically discloses a nano-enzyme based on human ferritin and a preparation method thereof. The preparation method takes human ferritin as fusion partner, places the target enzyme on its N terminal for fusion expression, and inserts a ligand peptide between the target enzyme and human ferritin. The preparation method can remarkably improve the catalytic activity of the target enzyme to the substrate and make the enzyme more tolerant to temperature and pH. The preparation method is not only limited to the fusion expression of human ferritin with Methyl Parathion Hydrolase and Escherichia coli alkaline phosphatase, but also suitable for the fusion expression of human ferritin with a variety of enzymes to improve the characteristics of target enzymes. It has high research value and scientific significance in basic research and application.

【技术实现步骤摘要】
一种基于人铁蛋白的纳米酶及其制备方法
本专利技术涉及基因工程
，具体地，涉及一种基于人铁蛋白的纳米酶及其制备方法。
技术介绍
重组人铁蛋白重链（recombinantheavychainofhumanferritin,rHF,以下简称人铁蛋白）是目前研究得较为清晰的具有纳米结构特性的蛋白质，具有在体外自组装形成24聚体笼形纳米颗粒的特性。人铁蛋白较其他生物大分子型的纳米元件相对简单，修饰和组装技术也相对成熟，可以通过基因工程手段连接功能性蛋白，特别是与人铁蛋白N端融合，并不影响纳米颗粒的完整性，且组装后功能分子被展示在笼形结构的表面，这些特点都赋予了人铁蛋白在纳米材料领域独特的优势，使得人铁蛋白成为一种构建自组装纳米颗粒的完美模块。对硫磷类有机磷农药作为一种广泛用于农业生产行列的产品，已被列为最毒物质之一。它的神经毒性是由于对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，该酶在神经系统中可以正常降解神经递质乙酰胆碱，从而使神经系统功能紊乱。在农业生产中，因病虫害所造成的有机磷农药的滥用使得农药在土壤、水资源、农产品，甚至食物链的残留，破坏农业生态，严重威胁着人类健康，因此迫切需要发展一种高效无污染的对硫磷类农药降解方法和高灵敏度检测手段。甲基对硫磷水解酶（Methylparathionhydrolase,MPH,EC3.1.8.1）是在2001年由中国科学院武汉病毒研究所从筛选出来的一株甲基对硫磷降解菌（Pseudomonassp.strainWBC-3）中分离纯化出来的对硫磷类重要代谢酶。研究发现，MPH可以降解甲基对硫磷、乙基对硫磷、毒死俾等。虽然已有研究人员成功构建了MPH的大肠杆菌表达系统，并且成功实现了MPH在异源宿主中的大量表达（楚晓娜，2003；刘璐璐等，2004），但是这对于迫切希望提高降解速率和检测灵敏度方法学的研究而言还是远远不够的。碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,AP,EC3.1.3.1）属于非特异性磷酸单酯酶，具有催化磷酸单酯水解生成无机磷酸和相应的醇、酚或糖类化合物的功能。碱性磷酸酶来源广泛，且不同来源的分子大小、编码序列差异很大，在结构、功能与催化机理上也略有不同。其中，对大肠杆菌碱性磷酸酶（Escherichiacolialkalinephosphatase，EAP）的研究最为透彻，EAP是一个同源二聚体金属酶，因其催化机理清楚且作用底物广泛，目前被广泛应用于医学、免疫学等领域。人铁蛋白纳米颗粒广泛用于生物传感器、疫苗的开发、药物的靶向释药系统的研究和应用，但是基于人铁蛋白纳米结构而构建的甲基对硫磷水解酶及大肠杆菌碱性磷酸酶的重组蛋白（纳米酶），以及针对这两种纳米酶催化体系的研究目前尚无报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种基于人铁蛋白的纳米酶及其制备方法。本专利技术将甲基对硫磷水解酶或大肠杆菌碱性磷酸酶置于人铁蛋白的N端进行融合表达，这两种酶可分别在大肠杆菌中自组装形成纳米颗粒，酶活性及稳定性皆有提高，本专利技术所述制备方法可解决酶活性不高、最适pH及最适温度过窄等问题，扩大酶的应用范围。本专利技术的另一目的在于提供由上述制备方法制备得到的纳米酶。本专利技术的另一目的在于提供一种编码上述纳米酶的融合基因。本专利技术的另一目的在于提供一种含有上述核酸的表达载体。本专利技术的另一目的在于提供一种含有上述表达载体的宿主菌。本专利技术的另一目的在于提供一种用于降解有机磷农药或催化磷酸单酯水解的制剂。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：一种基于人铁蛋白的纳米酶的制备方法，以人铁蛋白为融合伴侣，将目标酶置于其N端进行融合表达，在目标酶与人铁蛋白之间插入连接肽。所述连接肽为柔性连接肽，其序列为GGGGS。本专利技术所述制备方法能够显著提高目标酶对底物的催化活性，且使酶对温度及pH有更强的耐受性，具有高效、简便、适用面广等特点，适用于基因工程、生物化学、分子生物学等研究。优选地，所述制备方法包括如下步骤：克隆人铁蛋白和目标酶基因，拼接获得人铁蛋白-连接肽-目标酶融合蛋白基因，构建重组质粒，转化大肠杆菌宿主菌，筛选获得工程菌株，培养工程菌，诱导人铁蛋白-连接肽-目标酶融合蛋白的表达，经镍离子亲和层析纯化，分离获得人铁蛋白-连接肽-目标酶融合蛋白。优选地，所述目标酶为水解酶。更优选地，所述水解酶为甲基对硫磷水解酶或大肠杆菌碱性磷酸酶。下面以甲基对硫磷水解酶和大肠杆菌碱性磷酸酶为例说明本专利技术的特点：以人铁蛋白（rHF）为融合伴侣，将甲基对硫磷水解酶（MPH）或大肠杆菌碱性磷酸酶（EAP）融合于rHF的N端，构建融合表达载体pET28a-MPH-rHF或pET28a-EAP-rHF。这两种融合蛋白MPH-rHF和EAP-rHF都可高效表达于大肠杆菌内，通过镍离子亲和层析可获得高纯度的MPH-rHF和EAP-rHF。通过透射电镜对融合蛋白的聚集形式进行检测，发现融合蛋白MPH-rHF和EAP-rHF在体外成功地自组装形成纳米结构，表明在rHF的N端融合MPH或EAP不影响rHF自组装形成笼形纳米结构。通过比较纳米酶MPH-rHF及游离酶MPH对底物（对甲基对硫磷）的水解活性，发现纳米酶MPH-rHF较游离酶MPH有更高的催化活性；相比于游离酶MPH，纳米酶MPH-rHF的最适温度由35℃变为40℃，最适pH由9.5变为10.5。通过比较纳米酶EAP-rHF及游离酶EAP对底物（对硝基苯磷酸,p-nitrophenylphosphate,pNPP）的催化活性，发现纳米酶EAP-rHF有更高的催化活性；相比于游离酶EAP，纳米酶EAP-rHF对温度和pH都有更高的耐受性。因此，本专利技术请求保护人铁蛋白在提高甲基对硫磷水解酶或大肠杆菌碱性磷酸酶的催化活性和/或稳定性中的应用；具体地，所述稳定性为酶对温度和pH的耐受性。本专利技术还请求保护由上述制备方法制备得到的纳米酶，所述纳米酶为融合蛋白，从N端到C端依次为目标酶、连接肽和人铁蛋白。优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1～SEQIDNO:2中的任一条。所述融合蛋白MPH-rHF的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。所述融合蛋白EAP-rHF的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还请求保护一种编码上述纳米酶的融合基因，所述融合基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3～SEQIDNO:4中的任一条。所述融合基因MPH-rHF的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。所述融合基因EAP-rHF的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。本专利技术还请求保护一种含有上述核酸的表达载体，所述表达载体为pET28a-MPH-rHF或pET28a-EAP-rHF。本专利技术还请求保护一种含有上述表达载体的宿主菌，所述宿主菌为E.coliBL21（DE3）或E.coliBL21（DE3）pLysS感受态细胞。本专利技术还请求保护一种用于降解有机磷农药或催化磷酸单酯水解的制剂，所述制剂包括上述纳米酶、融合基因、表达载体或宿主菌。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：通过本专利技术所提供的制备方法形成纳米酶（融合蛋白），分别提高了甲基对硫磷水解酶或大肠杆菌碱性磷酸酶对底物的催化活性，增强了酶对温度、pH的耐受性。该制备方法不仅限于人铁蛋白与甲基对硫磷水解酶和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于人铁蛋白的纳米酶的制备方法，其特征在于，以人铁蛋白为融合伴侣，将目标酶置于其N端进行融合表达，在目标酶与人铁蛋白之间插入连接肽。

【技术特征摘要】
1.一种基于人铁蛋白的纳米酶的制备方法，其特征在于，以人铁蛋白为融合伴侣，将目标酶置于其N端进行融合表达，在目标酶与人铁蛋白之间插入连接肽。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，包括如下步骤：克隆人铁蛋白和目标酶基因，拼接获得人铁蛋白-连接肽-目标酶融合蛋白基因，构建重组质粒，转化大肠杆菌宿主菌，筛选获得工程菌株，培养工程菌，诱导人铁蛋白-连接肽-目标酶融合蛋白的表达，经镍离子亲和层析纯化，分离获得人铁蛋白-连接肽-目标酶融合蛋白。3.根据权利要求1或2任一所述制备方法，其特征在于，所述目标酶为水解酶。4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述水解酶为甲基对硫磷水解酶或大肠杆菌碱性磷酸酶。5.由权利要求1～4任一项所述制备方法制备得到的纳米酶，其特征在于，所述纳米酶为融合蛋白，从N端到C端依次为目标酶、...

【专利技术属性】
技术研发人员：文继开，陈庆梅，张艳，邓诣群，吴骏，蒋珺，胡泰斗，胡章盛，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44