本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体CD19‑CD8H&TM‑41BB‑CD3ζ‑mbIL15及其用途，该嵌合抗原受体由鼠抗人CD19单克隆抗体(克隆号FMC63)的重链和轻链可变区(CD19scFv)、人CD8α铰链区和跨膜区、人41BB胞内区、以及人CD3ζ胞内区和IL15+IL15Rα结构串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰人的T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR‑T细胞)能用于表达CD19阳性急性/慢性淋巴细胞白血病和淋巴瘤的治疗。本发明专利技术制备的CD19 mbIL15 CAR‑T细胞对特异性肿瘤细胞具强烈的杀伤功能。
【技术实现步骤摘要】
靶向CD19的嵌合抗原受体并联合表达IL-15的方法和用途
本专利技术属于嵌合抗原受体领域，具体涉及CD19的嵌合抗原受体及其用途。
技术介绍
嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素(Science.1986.233(4770):p.1318-21.)。随着嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)技术的不断发展，目前CAR-T主要可划分为四代。第一代CAR-T细胞由胞外结合区-单链抗体(single-chainfragmentvariable,scFV)、跨膜区(transmembraneregion,TM)和胞内信号区——免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)组成，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD3ζ。第一代CAR虽然能够看到一些特异性的细胞毒性，但2006年对其进行临床试验总结的时候却发现疗效差强人意。究其原因是因为第一代CAR-T细胞在病人体内很快就会耗竭，其持久性(persistence)很差，以至于CAR-T细胞还没有来得及接触到大量的肿瘤细胞时就已经凋亡了该种CAR-T细胞可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，但其在体内的存活期较短不能激发持久的抗肿瘤效应。[ZhangT.et.al.CancerRes2007,67(22):11029-11036.]第二代CAR-T细胞优化CAR设计中T细胞活化信号区仍然是研究的热点。T细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号，由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第二信号为协同刺激信号。早在1998年就出现了第二代CAR(FinneyHMetal.JImmunol.1998；161(6):2791-7.)。第2代CAR在胞内信号肽区添加了一个协同刺激分子，即把协同刺激信号组装到CAR里面，能够更好的为CAR-T细胞提供活化信号，这样CAR识别肿瘤细胞后能够同时活化协同刺激分子和胞内信号，实现双重活化，能明显提高T细胞增殖分泌能力和抗肿瘤效应。第一个被详细研究的T细胞共刺激信号受体是CD28，它能够与靶细胞表面的B7家族成员结合。CD28的共刺激能够促进T细胞的增殖，IL-2的合成和表达以及增强T细胞抵抗凋亡的能力。随后又出现了CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等共刺激分子，以提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长T细胞存活时间等。这样的第二代CAR在随后的临床试验中产生了意想不到的效果，从2010年起基于第二代CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于复发性、难治性的ALL病人，其完全缓解率高达90％以上。第三代CAR信号肽区整合2个以上的协同刺激分子，可使T细胞持续活化增殖，细胞因子持续分泌，T细胞杀伤肿瘤细胞的能力更加显著，即新一代的CAR可获得更强的抗肿瘤应答(PuleMAetal.MolTher.2005,12(5):933-941.)。最典型的就是UPenCarlJune在CD28刺激因子的作用下又加了一个CD137(4-1BB)的刺激因子。第四代的CAR-T细胞则加入了细胞因子或共刺激配体，例如四代CAR可以产生IL-12,其能够调节免疫微环境-增加T细胞的激活，同时激活固有免疫细胞使其发挥作用来清除靶抗原阴性的癌细胞，从而达到双向调节的作用。[ChmielewskiM,AbkenH.ExpertOpinBiolTher.2015；15(8):1145-54.]CD19是一种B细胞表面的95kDa的糖蛋白，从B细胞发育的早期即开始表达，直至其分化为浆细胞。CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员之一，作为B细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与调控了B细胞受体的信号转导过程。在CD19缺陷的小鼠模型中，外周淋巴组织中B细胞的数量会出现明显的减少，对疫苗和丝裂原的应答也会下降，同时伴有血清Ig水平的减低。通常认为，CD19的表达只限于B细胞系(B-celllineage)，而不表达于多能造血干细胞表面。CD19还表达于大多数B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALLs、CLLs、多毛细胞白血病，和一部分急性髓性白血病细胞的表面。因此，在对白血病/淋巴瘤的治疗中，CD19是一种非常有价值的免疫治疗靶点。重要的是，CD19不会表达于除B细胞外的大多数正常细胞表面，包括多能造血干细胞，这一特征使CD19可以作为一种安全的治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。当前，已经研制出了抗CD19的抗体或scFv片段，并且在小鼠模型和人类/灵长类动物中证明了其应用的前景。白细胞介素15(interleukin15，IL-15)是1994年发现的一种细胞因子，是由114个氨基酸组成的14-15KD大小的糖蛋白，属于四螺旋束细胞因子家族中的一员。IL-15在结构上与白细胞介素2(interleukin2，IL-2)有同源性，受体由具有高亲和力的IL-15受体a链、IL-2/15受体β链以及公共链γ链组成。因此IL-15具有一些和IL-2相近的功能，比如刺激T细胞活化和增殖，增强NK细胞杀伤活性并促进B细胞产生免疫球蛋白。最近研究发现IL-15在NK细胞、NKT细胞以及肠上皮细胞的分化、增殖、活化过程中发挥了重要作用，IL-15与IL-17对CD8记忆性T细胞的稳态调节非常重要。研究还证明IL-15通过一种特殊的“反递呈”机制来调控CD8记忆性T细胞的增殖和NK细胞的生存周期，即一种表达IL-15α链受体的细胞能够将IL-15递呈给表达IL-15B链和γ链的细胞。更多的研究表明IL-15是一种有广泛生物学功能的功能强大的细胞因子，除了对免疫系统有着重要的调节作用，在非免疫系统中也同样重要，比如对骨骼肌合成代谢也发挥重要调节作用。本专利技术对构建的靶向CD19的二代CAR,共刺激因子为41BB，本专利技术对此CAR进行了修饰即引入了IL15结构，IL15是功能强大的细胞因子，对免疫系统有着重要的调节作本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)含有依次连接的抗CD19单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、和IL15+IL15Rα结构编码序列的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)含有依次连接的抗CD19单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD8跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、和IL15+IL15Rα结构编码序列的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。2.如权利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列在所述CD19单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列，优选地，所述信号肽的多核苷酸序列如SEQIDNO:1-63第位多核苷酸所示；和/或所述CD19单链抗体的轻链可变区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第64-321位多核苷酸所示；和/或所述CD19单链抗体的重链可变区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第430-789位多核苷酸所示；和/或所述人CD8α铰链区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第790-930位多核苷酸所示；和/或所述人CD8跨膜区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第931-996位多核苷酸所示；和/或所述人41BB胞内区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第997-1140位多核苷酸所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1141-1473位多核苷酸所示；和/或所述人IL-15与IL15Rα的多核苷酸序列如SEQIDNO:1第1606-2736位多核苷酸所示。3.如权利要求2所述的氨基酸序列，其特征在于，在所述抗CD19单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQIDNO:2第1-21位氨基酸序列所示；和/或所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQIDNO:2第22-128位氨基酸序列所示；和/或所述抗CD19单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQIDNO:2第144-263位氨基酸序列所示；和/或所述人CD8α铰链区的编码序列如SEQIDNO:2第264-310位氨基酸序列所示；和/或所述人CD8跨膜区的编码序列如SEQIDNO:2第311-332位氨基酸序列所示；和/或所述人41BB胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第333-380位氨基酸序列所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQIDNO:2第381-491位氨基酸序列所示；和/或所述人IL-15与IL15Rα的片段的编码序列如SEQIDNO:2第650-912位氨基酸序列所示。4.一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：(1)含有依次连接的抗CD19单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、人41BB胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白、和IL15+IL15Rα编码序列；和(2)在(1)限定的氨基酸序列中...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄飞，金涛，王海鹰，何凤，史子啸，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。