本发明专利技术属于生物检测领域，更具体地、涉及一种检测及定性高脂血症大鼠血清中的差异金属蛋白质的方法。本发明专利技术通过2D‑ICP‑MS联合MALDI‑TOF‑MS的方法，检测及定性高脂血症大鼠血清中差异金属蛋白质。包括如下步骤：(1)二维电泳法分离血清蛋白质；(2)ICP‑MS检测金属蛋白；(3)MALDI‑TOF‑MS鉴定金属蛋白。该方法原理简单、易行。经实验，本发明专利技术能够检测出两种因患高脂血症而带有金属铬的蛋白质谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx‑3)和载脂蛋白aI(ApoaI)。为进一步阐明血脂的代谢机制和高脂血症的治疗提供基础和新思路。
A method for detection and characterization of differential metal proteins in rat serum
The invention belongs to the field of biological detection, and more specifically relates to a method for detecting and determining differential metal proteins in serum of hyperlipidemia rats. The invention detects and qualitatively characterizes the differential metalloproteins in the serum of hyperlipidemia rats by the method of two-dimensional ICP MS combined with MALDI TOF MS. It includes the following steps: (1) separation of serum proteins by two-dimensional electrophoresis; (2) detection of metalloproteins by ICP MS; (3) identification of metalloproteins by MALDI TOF MS. The method is simple and feasible. Two proteins, glutathione peroxidase (Gpx_3) and apolipoprotein aI (ApoaI), with metal chromium, can be detected by the present invention. It provides a new basis for further clarifying the metabolic mechanism of lipid and the treatment of hyperlipidemia.
【技术实现步骤摘要】
一种检测及定性大鼠血清中的差异金属蛋白质的方法
本专利技术属于生物检测领域，更具体地、涉及一种检测及定性高脂血症大鼠血清中的差异金属蛋白质的方法。
技术介绍
蛋白质是生物体的基本组成物质，也是生物体各种功能的执行者。研究表明，人体内有三分之一的蛋白与金属元素结合成金属蛋白。而金属离子常常作为活性中心或协同因子完成蛋白质的多种反应。金属蛋白组学主要有三种研究方法。首先是广泛使用的质谱分析技术，特别是电喷雾电离质谱(ESI-MS)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)。这两种技术特别适用金属蛋白综合结构和功能特征的分析。第二种方法是高通量X射线吸收光谱法(HT-XAS)，以提供对组织和细胞中蛋白质和蛋白质金属分布的直接金属分析。第三种方法是通过计算生物信息学分析。随着基因组测序的进行，已经建立了蛋白质一级结构的大型数据库。目前，还开发了鉴定基因组序列中的金属蛋白的具体工具。将氨基酸序列代入已知金属结合区域中已知的同源序列，可以预测金属结合特性。该方法已被用于预测蛋白质中的锌、铜和其它痕量金属。目前可用于人体微量元素检测的方法有原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体原子吸收光谱法(ICP-AES)、同位素稀释质谱法(ID-MS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、x射线荧光分析法(XRF)、中子火花分析法(INAA)、电化学分析法、分子光谱法、生化法等，其中ICP-AES和AAS法是应用最广泛的两个方法，尤其是石墨炉原子吸收光谱法(GF-AAS)，但是ICP-AES法分析生物样品集体效应难以解决，而且有些元素不能测量，如As、Hg、Pb、Cd等，需要再利用GF-AAS技术进行测定。另外，ICP-AES法存在对样品需求量大的问题；GF-AAS不适宜使用有机溶剂，分析速度慢，且基体干扰很严重，测定不同元素时必须采用不同的基体改进剂。其复杂的操作步骤、较低的工作效率限制了它的广泛应用，更重要的是，在分析Hg、Tl、U、B等元素时，GF-AAS的检测限不能满足体液等生物样品的分析要求。ICP-MS技术提供了最低的检出限和最宽的线性范围，而且干扰少、分析速度快、精密度高、可多元素同时测定以及可提供精确的同位素信息等优点。六十年代开始，质谱广泛地应用与有机化学中分子量和结构的测定，传统的质谱方法能够很好地测定一些分子量较小的化合物，但是在测量生物样品时，由于其极性大、难挥发、不易气化、热不稳定等特点，传统质谱存在局限性。80年代末期，出现了两种新型质谱软电离技术电子喷雾离子化(ElectrosprayIonization,ESI)和基质辅助激光解吸离子化(Matrix-AssistedLaserDesorption/Ionization,MALDI)，成为生物样品分析中最重要和最有发展前景的技术之一。因此，目前亟待一种用于复杂样品中差异金属蛋白检测和定性的方法。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种用于检测及定性大鼠血清中的差异金属蛋白质的方法。该方法原理简单、易行。经实验，检测出两种因患高脂血症而带有金属铬的蛋白质谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx-3)和载脂蛋白aI(ApoaI)。为进一步阐明血脂的代谢机制和高脂血症的治疗提供基础和新思路。本专利技术通过如下方法实现的：本专利技术通过2D-ICP-MS联合MALDI-TOF-MS的方法，检测及定性高脂血症大鼠血清中差异金属蛋白质。本专利技术所述的方法，包括如下步骤：(1)二维电泳法分离血清蛋白质；(2)ICP-MS检测金属蛋白；(3)MALDI-TOF-MS鉴定金属蛋白。具体地，步骤(1)包括高丰度蛋白的去除、蛋白的定量、一向等电聚焦电泳、二维SDS-PAGE、银染。所述的高丰度蛋白的去除包括如下步骤：a、去除低丰度蛋白试剂盒中柱子下面的盖子，离心，弃去上清液；b、柱子中加入洗脱液，放置柱子，离心，弃去上清液；c、将样品加入柱子中，室温旋转，离心，去除上清液，再离心；d、加洗脱液于柱子中，旋转，离心，去除上清液，重复该步骤2-3次；e、加超纯水于柱子中，旋转，离心，去除上清液；f、加入再水化洗脱液，涡旋，把柱子放入干净的收集管中，离心，该步骤重复2-3次，合并两次的离心得到的溶液。步骤b所述的洗脱液与步骤f所述的再水化洗脱液为试剂盒中配套试剂步骤a-f中离心时间为：30-60sec转速为：4000rpm步骤f中涡旋时间为t≥15min所述的蛋白的定量采用Bradford法测定蛋白质浓度。所述的一向等电聚焦电泳是将蛋白样品与水化上样缓冲液、4.5mg1％DTT、0.5％～1％两性电解质混合均匀，连续、线性地加入到聚焦盘中。保持20℃。所述的二维SDS-PAGE的步骤是：取出IPG胶条，分别放入平衡缓冲液A和缓冲液母液B中作用10-15分钟。垂直向SDS-PAGE使用12％(质量分数)的凝胶。所述的平衡缓冲液A为：尿素6M、甘油20％、SDS2％、pH8.8的Tris-HCl0.375M；所述的缓冲液母液B为：0.4g碘乙酰胺溶于10mL超纯水。所述的银染方法如下：用固定液振摇，然后用超纯水清洗2-3次，每次振摇10-15min。使用0.02％Na2S2O3水溶液敏化3-5min，超纯水清洗2-3次，每次20-30s。用0.1％的AgNO3避光振摇30min以上，用超纯水稍作清洗。用显色液显色至蛋白斑点清晰可见。最后用终止液(1.46％EDTA·Na2)振摇约1-2min。多次水洗待用。所述的固定液配方为：45％甲醇、5％乙酸、50％超纯水；所述的显色液的配制方法为：取1gNaCO3，精密称量，再取32μL甲醛，一起溶解至50mL超纯水中。步骤(2)中ICP-MS检测金属蛋白的步骤如下；切割蛋白点，精密称定，蛋白点面积较小的点，切取空白部分的胶补齐，使所有抠取的蛋白点的质量保持一致。同时切取一份不含蛋白点的空白凝胶。将称取的凝胶放置在消解罐中，加入1mL硝酸，在电加热板上以160-170℃加热溶解完全，冷却到室温，移至LEP管中，加水稀释至1.5mL，混匀。测定Fe、Cu、Zn、Se、Cr。采用四级杆电感耦合等离子体质谱进行样品测定。步骤(3)中MALDI-TOF-MS鉴定金属蛋白的步骤如下：a、胶粒脱色脱色液的配制：100mM的Na2S2O3和30mM的K3(Fe(CN)6)按1:1的比例混合均匀即得。脱色液呈黄色。将胶粒放置于适量脱色液中20-30min后，用超纯水清洗至无色。b、胶内酶解将脱色的胶粒冻干，加入0.01mg/mL的胰蛋白酶溶液(含50mMNH4HCO3,5mMCaCl2)，在4℃下放置45min，令胶块充分膨胀。然后于37℃水浴酶解15-16h，用5％的TFA水溶液提取酶解肽段，提取液至于-80℃冰箱内备用。C、ZiptipC18微柱脱盐先用乙腈洗柱一次，再用50％乙腈/0.1％TFA洗柱一次，最后用0.1％的TFA洗柱多次，平衡ZiptipC18柱。用移液枪吸取样品，并反复吹打30次，使肽段混合物充分吸附在柱子上。吸取CHCA溶液3μL(配制方法：0.3％的氰-4-羟基苯丙烯酸，用70％乙腈/0.1％TFA稀释)，在离心管中反复吸打5次式样品和基质充分混合。点在MALDI的靶上，自然晾干结晶。本专利技术的方法原理简单、易行。经本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测及定性高脂血症大鼠血清中的差异金属蛋白质的方法，其特征在于，通过2D‑ICP‑MS联合MALDI‑TOF‑MS的方法，检测及定性高脂血症大鼠血清中差异金属蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种检测及定性高脂血症大鼠血清中的差异金属蛋白质的方法，其特征在于，通过2D-ICP-MS联合MALDI-TOF-MS的方法，检测及定性高脂血症大鼠血清中差异金属蛋白质。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差异性金属蛋白质为带有金属铬的蛋白质谷胱甘肽过氧化物酶和载脂蛋白aI。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)二维电泳法分离血清蛋白质；(2)ICP-MS检测金属蛋白；(3)MALDI-TOF-MS鉴定金属蛋白。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括高丰度蛋白的去除、蛋白的定量、一向等电聚焦电泳、二维SDS-PAGE、银染。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中ICP-MS检测金属蛋白的步骤如下：切割蛋白点，同时切取一份不含蛋白点的空白凝胶，将...
【专利技术属性】
技术研发人员：王淼，冯流星，赵春杰，赵旻，韩雪，阎旭，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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