本发明专利技术涉及一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法，属于医药生物工程技术领域。本发明专利技术所述方法包括一级种子培养步骤、二级种子培养步骤、三级种子培养步骤、发酵培养步骤。本发明专利技术中重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)细胞扩增、培养表达后的细胞密度比现有基因重组乙肝疫苗细胞扩增、培养表达的细胞密度更高，HBsAg表达量更高，且HBsAg颗粒结构完整，细胞颗粒大小均一。
A highly efficient method for HBsAg expression based on recombinant Hansen cells
The invention relates to a method for efficiently cultivating and expressing hepatitis B surface antigen based on recombinant Hansen yeast cell technology, and belongs to the field of Medical Bioengineering technology. The method comprises a primary seed culture step, a secondary seed culture step, a third seed culture step, and a fermentation culture step. The cell density of the recombinant hepatitis B vaccine (Hansen yeast) after cell expansion and culture expression is higher than that of the existing recombinant hepatitis B vaccine cells, and the expression of HBsAg is higher, and the structure of HBsAg particles is complete, and the cell size is uniform.
【技术实现步骤摘要】
一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法
本专利技术涉及一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法，属于医药生物工程
技术介绍
乙型病毒性肝炎(viralhepatitistypeB，简称乙肝)系由乙肝病毒(HBV)引起，以乏力、食欲减退、恶心、呕吐、厌油、肝大及肝功能异常为主要临床表现。部分病例有发热和黄疸；少数病例病程迁延转为慢性，或发展为肝硬化甚至肝癌；重者病情进展迅猛可发展为重型肝炎；另一些感染者则成为无症状的病毒携带者。乙型肝炎病毒简称乙肝病毒。是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)。根据目前所知，HBV就只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙肝病毒成颗粒状，也会被称为丹娜颗粒(Dane)。1965年由丹娜发现，直径为42纳米，颗粒分为外壳和核心两部分。乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。HBV的抵抗力较强，但65℃10h、煮沸10min或高压蒸气均可灭活HBV。含氯制剂、环氧乙烷、戊二醛、过氧乙酸和碘伏等也有较好的灭活效果。目前国际上流行的乙肝疫苗为基因重组乙肝疫苗。基因重组乙肝疫苗又分为哺乳动物细胞表达的疫苗和重组酵母乙肝疫苗。基因重组乙肝疫苗是利用转基因技术，构建含有乙肝病毒HBsAg基因的重组质粒，转入酵母(啤酒酵母.毕赤酵母或汉逊酵母)或重组中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的乙型肝炎表面抗原。现有的基因重组技术构建的乙肝疫苗细胞缺点见下表1：表1现有的基因重组技术构建的乙肝疫苗细胞缺点
技术实现思路
本专利技术经一级种子接种、培养，二级种子接种、培养，三级种子接种、培养，发酵接种、扩增培养表达得到发酵培养物，通过本方法能够表达、形成与天然乙型肝炎病毒颗粒大小一致的类病毒颗粒，且细胞发酵密度高，抗原表达量高。本专利技术提供了一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法，所述方法包括一级种子培养步骤、二级种子培养步骤、三级种子培养步骤、发酵培养步骤；所述发酵培养步骤为：取25L三级种子培养物接种于100-150L发酵培养基中，28-32℃培养88-95h；所述发酵培养基，按重量份，由下述组份组成：生长期的搅拌速度由200rpm增加至500rpm，pH值为4.85-5.25，空气流量由100L/min增加至300L/min，溶氧不低于10％；补料期保持生长期的发酵条件不变，当溶氧升至最大值时，加入8-10L甘油，反复6-8次；诱导期的搅拌速度由500rpm降低至450rpm，pH值为5.35-5.75，空气流量由150L/min降低至20L/min，溶氧为60-90％，并且，在加入最后一次甘油后溶氧升至最大值时，开始先流加体积比为1：4-6的甘油甲醇混合液25-30L，再流加甲醇70-80L，流加的速度为10-40mL/min。本专利技术优选为所述三级种子培养步骤为：取3L二级种子培养物接种于30-45L三级种子培养基中，28-32℃培养13-15h，搅拌速度由200rpm增加至400rpm，pH值为4.85-5.25，空气流量为10-15L/min，溶氧不低于20％；所述三级种子培养基，按重量份，由下述组份组成：硫酸铵7.50份酵母氮源培养基10.05份甘油0.038份。本专利技术优选为所述二级种子培养步骤为：取200mL一级种子培养物接种于3-4L二级种子培养基中，29-31℃培养19.5-20.5h，摇床转速为190-210rpm；所述二级种子培养基，按重量份，由下述组份组成：硫酸铵7.50份酵母氮源培养基10.05份甘油0.038份。本专利技术优选为所述一级种子培养步骤为：将1mL重组汉逊酵母工作种子批工程菌种接种于300-350mL一级培养基中，29-31℃培养19.5-20.5h，摇床转速190-210rpm；所述一级培养基，按重量份，由下述组份组成：本专利技术中重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)细胞扩增、培养表达后的细胞密度比现有基因重组乙肝疫苗细胞扩增、培养表达的细胞密度更高，HBsAg表达量更高，且HBsAg颗粒结构完整，细胞颗粒大小均一。附图说明本专利技术附图6幅，图1为第一次重复实施例1时发酵过程细胞培养、表达图；图2为第二次重复实施例1时发酵过程细胞培养、表达图；图3为第三次重复实施例1时发酵过程细胞培养、表达图；图4为第一次重复实施例1时重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)表达的HBsAg颗粒结构电镜检测图；图5为第二次重复实施例1时重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)表达的HBsAg颗粒结构电镜检测图；图6为第三次重复实施例1时重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)表达的HBsAg颗粒结构电镜检测图。具体实施方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。下述以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组汉逊酵母工程菌株，菌种号为HBsAgU35-16-9，引自《中国药典2015年版》第163页。下述一级培养基，按重量份，由下述组份组成：下述二级种子培养基，按重量份，由下述组份组成：硫酸铵7.50份酵母氮源培养基10.05份甘油0.038份。下述三级种子培养基，按重量份，由下述组份组成：硫酸铵7.50份酵母氮源培养基10.05份甘油0.038份。下述发酵培养基，按重量份，由下述组份组成：实施例1一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法，所述方法包括如下步骤：一级种子培养步骤：将1mL重组汉逊酵母工作种子批工程菌种接种于350mL一级培养基中，30℃培养20h，摇床转速200rpm，得到一级种子培养物；二级种子培养步骤：取200mL一级种子培养物接种于3L二级种子培养基中，30℃培养20h，摇床转速为200rpm，得到二级种子培养物；三级种子培养步骤：取3L二级种子培养物接种于30L三级种子培养基中，30℃培养13h，搅拌速度由200rpm增加至400rpm，pH值为5.05，空气流量为10L/min，溶氧不低于20％，得到三级种子培养物；发酵培养步骤：取25L三级种子培养物接种于140L发酵培养基中，30℃培养92h；生长期的搅拌速度由200rpm增加至500rpm，pH值为4.85-5.25，空气流量由100L/min增加至300L/min，溶氧不低于10％；补料期保持生长期的发酵条件不变，当溶氧升至最大值时，加入甘油，反复6次，前2次分别加入8L甘油，后4次分别加入10L甘油；诱导期的搅拌速度由500rpm降低至450rpm，pH值为5.35-5.75，空气流量由150L/min降低至20L/min，溶氧为60-90％，并且，在加入最后一次甘油后溶氧升至最大值时，开始先流加体积比为1：5的甘油甲醇混合液30L，再流加甲醇70L，流加的速度为10-40mL/min。依据实施例1重复3次。测试例1实施例1得到的细胞密度检测：取1mL均匀发酵液，13000rpm离心4min，除去上清液，称固体物即发酵液细胞密度，结果见下表2。表2重复3次实施例1得到的细胞密度检测值细胞密度检测值(g/mL)第一次重复0.5250第二次重复0.5326第三次重复0.5210测试例2抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法，其特征在于：所述方法包括一级种子培养步骤、二级种子培养步骤、三级种子培养步骤、发酵培养步骤；所述发酵培养步骤为：取25L三级种子培养物接种于100‑150L发酵培养基中，28‑32℃培养88‑95h；所述发酵培养基，按重量份，由下述组份组成：
【技术特征摘要】
1.一种基于重组汉逊酵母细胞技术高效培养、表达乙肝表面抗原的方法，其特征在于：所述方法包括一级种子培养步骤、二级种子培养步骤、三级种子培养步骤、发酵培养步骤；所述发酵培养步骤为：取25L三级种子培养物接种于100-150L发酵培养基中，28-32℃培养88-95h；所述发酵培养基，按重量份，由下述组份组成：生长期的搅拌速度由200rpm增加至500rpm，pH值为4.85-5.25，空气流量由100L/min增加至300L/min，溶氧不低于10％；补料期保持生长期的发酵条件不变，当溶氧升至最大值时，加入8-10L甘油，反复6-8次；诱导期的搅拌速度由500rpm降低至450rpm，pH值为5.35-5.75，空气流量由150L/min降低至20L/min，溶氧为60-90％，并且，在加入最后一次甘油后溶氧升至最大值时，开始先流加体积比为1：4-6的甘油甲醇混合液25-30L，再流加甲醇70-80L，流加的速度为10-40mL/min。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：李贵兴，张平，陈新亭，李纯厚，姜晓娟，刘立斌，
申请(专利权)人：艾美汉信疫苗大连有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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