一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗菌剂中的应用技术

本发明专利技术提供了一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗菌剂中的应用，所述海洋曲霉为曲霉（Aspergillus sp.）ZA‑01菌株，保藏日期为2018年1月25日，保藏编号为CGMCC No.15270，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述化合物的结构式为

【技术实现步骤摘要】
一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗菌剂中的应用
本专利技术涉及海洋天然药物化学领域，具体地说涉及一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗菌剂中的应用。
技术介绍
海洋约占地球总表面积的71％，其蕴含了丰富多样的生物资源，是人类进行药物研发的宝贵资源库。自20世纪40年代以来，以头孢菌素、阿糖胞苷和ET-743为代表的多种海洋来源药物被成功运用到临床上。海洋来源真菌微生物资源因为其代谢产物丰富和可重复发酵等优点成为海洋药物最重要的来源之一，其中，以海洋真菌来源的氧杂蒽醌类化合物为代表的抗肿瘤活性化合物已经成为现代海洋药物研究的重要课题。目前，已报道的海洋真菌来源氧杂蒽醌类化合物的种类有限，且对其抗菌活性研究较少，目前尚未有关于本专利技术氧杂蒽醌类化合物及其抗多种病原菌活性的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一就是提供一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法，以解决现有技术中海洋真菌来源氧杂蒽醌类化合物的种类及抗菌活性有限的问题。本专利技术的目的之二就是提供一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物在制备抗菌剂中的应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种海洋曲霉，所述海洋曲霉为曲霉(Aspergillussp.)ZA-01菌株，保藏日期为2018年1月25日，保藏编号为CGMCCNo.15270，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。1.样品来源海洋曲霉ZA-01菌株分离自海洋沉淀物，所述海洋沉淀物样品于2015年6月采自河北省沧州市黄骅港海域。海底沉淀物样品采集后，立刻放于–20℃冰箱中保存，并送往实验室进行后续真菌的分离工作。2.真菌的分离2.1培养基的选择(1)PDA培养基马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，海盐30g，琼脂20g，水1000mL。分离真菌时加25μg/mL硫酸链霉素，25μg/mL氨苄青霉素，抑制细菌生长。(2)无盐PDA培养基马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。分离真菌时加25μg/mL硫酸链霉素，25μg/mL氨苄青霉素，抑制细菌生长(无盐PDA与加盐PDA对比)。(3)孟加拉红培养基马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，海盐30g，孟加拉红(roseBengal)33mg(抑制生长快的霉菌蔓延生长)，琼脂20g，水1000mL。2.2真菌的分离、纯化将上述海洋沉淀物样品置于无菌玻璃器中，加入1mL无菌水调至黏稠状。取出0.1mL上述液体用无菌水分别稀释10倍、100倍、1000倍，得到4个浓度梯度的匀浆液，用无菌移液管分别取0.2mL各浓度匀浆液分别加入PDA、无盐PDA、孟加拉红培养基中，用涂布器涂匀。每个浓度梯度分别做三个平行。用封口膜封好，并写上编号。以上分离实验均在无菌条件下进行。将上述加入样品的培养基分别放入28℃恒温箱，倒置培养。一般培养5–8d便有菌落或者菌丝体从培养基或者组织小块边缘长出来(细菌生长快，2–3d就有菌落生长出来)。用接种针挑取菌落或者菌丝体尖端，移至新的平板上，经几次分离纯化后，可获得真菌纯菌株。真菌分离工作一般进行35d。前两周每天检查一次，以后每隔3–4d检查一次。一旦发现有新的菌落或菌丝体长出，应马上将其转接到新的平板上。3、菌株的筛选采用活性筛选结合化学筛选的方法来筛选目标菌株。通过对菌株进行小规模发酵(2瓶)，获得粗浸膏，对粗浸膏进行抗菌活性测试，将对致病菌的抑制活性作为筛选目标菌株的考察因素之一；且对粗浸膏进行HPLC指纹图谱分析，将次级代谢产物量作为筛选目标菌株的考察因素之二，最终确定抑菌活性高且次级代谢产物丰富的菌株ZA-01为目标菌株，并对其进行鉴定。4、菌株的鉴定在PDA培养基平板上培养3-7d，生长至最佳状态的真菌，用灭菌枪头挑取单菌落上少量菌丝至装有50μLLysisbuffer(裂解液)的EP管中，于80℃水浴锅中热变性15min，然后8000rpm离心1min，取3μL上清液即为PCR反应的模板DNA。用于扩增和测序的引物为ITS1和ITS4，上下引物序列为：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGGITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGCPCR反应体系为40μL体系，包括：扩增条件为：扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液样，5V/cm电压，上样5μL电泳检测，DNAMarker指示分子量，凝胶成像仪观察并照相。将PCR扩增产物送北京三博远志公司进行测序，并最终鉴定为海洋曲霉(Aspergillussp.)。一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物，所述化合物的结构式为其中，R独立地为OH或OAc。所述化合物为一种上述的海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物的制备方法，包括如下步骤：(1)将权利要求1所述的海洋曲霉(Aspergillussp.)ZA-01菌株接种于菌种培养基中进行菌种培养；(2)菌种培养完成后，将其接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵物；(3)用乙酸乙酯对发酵物进行萃取2–4次，合并乙酸乙酯萃取液后减压浓缩得到粗浸膏；(4)对所得粗浸膏进行色谱分离即得所述氧杂蒽醌类化合物，所述的色谱分离为依次进行正相硅胶柱色谱分离、反相硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱分离和高效液相色谱分离。步骤(1)中所述菌种培养基为：葡萄糖1.0–10wt％、酵母膏0.1–4.0wt％、蛋白胨0.2–4.0wt％、琼脂1.0–6.0wt％、粗海盐3.0–10wt％，其余为水；菌种培养温度为15–35℃，培养时间为3–10天。步骤(2)中每单位份的所述发酵培养基包括大米60–150g、NaNO30.1–0.6g、KH2PO40.05–0.2g、MgSO4·7H2O0.02–0.1g、NaCl0.02–0.1g、FeSO40.01–0.05g、蔗糖2–6g、水50–150mL；发酵培养条件为在15–35℃下静置培养20–50天。步骤(4)中所述正相硅胶柱色谱分离为：先采用固定相为100～200目硅胶，流动相为15–25vol％乙酸乙酯/石油醚混合溶液进行洗脱，洗脱体积为3-5个柱体积，将所得洗脱液浓缩后再采用固定相为200～300目硅胶，流动相为65–75vol％二氯甲烷/甲醇混合溶液进行洗脱，洗脱体积为2-3个柱体积。步骤(4)中所述反相硅胶柱色谱分离采用的固定相为C18硅胶，流动相为60–70vol％甲醇/水混合溶液，洗脱体积为2-3个柱体积。步骤(4)中所述凝胶柱色谱分离的固定相为sephadexLH-20，流动相为二氯甲烷，洗脱体积为3-5个柱体积。步骤(4)中所述高效液相色谱分离中采用的色谱柱为半制备C18色谱柱，XBridgeOBD，5μm，10×250mm，流动相为75–80vol％的甲醇/水混合溶液；和半制备硅胶色谱柱，ViridisTMSilica2-Ethylpyridine，5μm，10×250mm，流动相为80–85vol％石油醚/乙醇混合溶液。一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物在制备抗菌剂中的应用，所述抗菌剂以上述的化合物或其药学上可接受的盐为有效成分。一种海洋曲霉来源的上述氧杂蒽醌类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗由溶壁微球菌(Micrococcusly本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海洋曲霉，其特征是，所述海洋曲霉为曲霉（Aspergillus sp.）ZA‑01菌株，保藏日期为2018年1月25日，保藏编号为CGMCC No.15270，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

【技术特征摘要】
1.一种海洋曲霉，其特征是，所述海洋曲霉为曲霉（Aspergillussp.）ZA-01菌株，保藏日期为2018年1月25日，保藏编号为CGMCCNo.15270，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物，其特征是，所述化合物的结构式为其中，R独立地为OH或OAc。3.一种权利要求2所述的海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物的制备方法，其特征是，包括如下步骤：（1）将权利要求1所述的海洋曲霉（Aspergillussp.）ZA-01菌株接种于菌种培养基中进行菌种培养；（2）菌种培养完成后，将其接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵物；（3）用乙酸乙酯对发酵物进行萃取2–4次，合并乙酸乙酯萃取液后减压浓缩得到粗浸膏；（4）对所得粗浸膏进行色谱分离即得所述氧杂蒽醌类化合物，所述的色谱分离为依次进行正相硅胶柱色谱分离、反相硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱分离和高效液相色谱分离。4.根据权利要求3所述的海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物的制备方法，其特征是，步骤（1）中所述菌种培养基为：葡萄糖1.0–10wt%、酵母膏0.1–4.0wt%、蛋白胨0.2–4.0wt%、琼脂1.0–6.0wt%、粗海盐3.0–10wt%，其余为水；菌种培养温度为15–35℃，培养时间为3–10天。5.根据权利要求3所述的海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物的制备方法，其特征是，步骤（2）中每单位份的所述发酵培养基包括大米60–150g、NaNO30.1–0.6g、KH2PO40.05–0.2g、MgSO4•7H2O0.02–0.1g、NaCl0.02–0...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹飞，朱华结，朱奡，刘云凤，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：河北,13