一种鸡新城疫病毒抗原表位多肽制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡新城疫病毒抗原表位多肽制备方法，属于抗原表位多肽的筛选技术领域。本发明专利技术的技术方案要点为：一种鸡新城疫病毒抗原表位多肽制备方法，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。采用鸡新城疫病毒表位多肽P25与新城疫病毒临床抗体反应，显示出较高的灵敏性和特异性，与其它家族疾病如IBDV和AIV抗体无交叉反应性，此外，多肽合成非常方便，不需要蛋白的纯化过程，提高了检测抗体过程中的稳定性。

Preparation method of antigen epitope polypeptide of chicken Newcastle disease virus

The invention discloses a preparation method of antigenic epitope polypeptide of chicken Newcastle disease virus, belonging to the technical field of screening antigenic epitope polypeptide. The technical scheme of the invention is mainly as follows: a preparation method of an antigen epitope polypeptide of Newcastle disease virus of chicken, and the amino acid sequence of the polypeptide is shown in the sequence table SEQ ID NO.1. The reaction of the epitope peptide P25 of Newcastle disease virus with the clinical antibody of Newcastle disease virus showed high sensitivity and specificity. There was no cross-reactivity with other family diseases such as IBDV and AIV antibodies. In addition, the peptide synthesis was very convenient, and the purification process of protein was not needed.

【技术实现步骤摘要】
一种鸡新城疫病毒抗原表位多肽制备方法
本专利技术属于抗原表位多肽的筛选
，具体涉及一种鸡新城疫病毒抗原表位多肽制备方法。
技术介绍
新城疫(NewcastleDisease)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)引起的一种急性、热性、败血性和高触性禽类传染病，其发病率与死亡率都很高，严重危害着我国养禽业的发展。新城疫病毒属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒属，单股负链RNA病毒，有囊膜，其基因组全长为15186bp，编码6个结构蛋白，包括磷蛋白(P)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、大蛋白(L)以及血凝素-神经氨酸蛋白(HN)六种蛋白。血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)具有血凝素活性(HA)及神经酸氨酶活性(NA)并能协同F蛋白发挥作用，在病毒感染过程中，HN蛋白特异性地识别宿主细胞表面唾液酸受体，这是病毒感染宿主细胞所必需的，并且能够诱导机体产生保护性免疫抗体。目前，常用的检测方法有血凝素反应(hemagglutinin，HA)、血凝抑制反应(hemagglutinininhibition，HI)、酶联免疫吸附试验法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)和实时定量PCR等检测方法，然而这些方法都比较耗时费力，需要实验室特殊的设备才能检测，并且不能及时地对鸡新城疫病毒的流行传播做出诊断。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供了一种鸡新城疫病毒抗原表位多肽制备方法，该抗原表位多肽与新城疫病毒临床抗体反应显示出较高的灵敏性和特异性。本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种鸡新城疫病毒抗原表位多肽制备方法，其特征在于其氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。本专利技术具有以下有益效果：采用鸡新城疫病毒表位多肽P25与新城疫病毒临床抗体反应，显示出较高的灵敏性和特异性，与其它家族疾病如IBDV和AIV抗体无交叉反应性，此外，多肽合成非常方便，不需要蛋白的纯化过程，提高了检测抗体过程中的稳定性。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本专利技术上述内容实现的技术均属于本专利技术的范围。实施例1.材料与方法1.1病毒株和血清NDV临床抗体分离自河南省某鸡场，禽流感病毒(AIV)抗体、鸡法氏囊病毒(IBDV)抗体本实验室保存；rabbitanti-chickenIgG购自SIGMA公司。1.2方法1.2.1新城疫病毒高免血清的制备将新城疫病毒接种于鸡成纤维细胞，72h后收获病毒，用蔗糖梯度离心的方法纯化NDV，以1mg/mL的浓度肌肉注射给2周龄的小鸡，当出现临床症状时采集血清。用多肽P25通过ELISA方法检测抗体滴度，将收集到的血清于56℃灭活30min，-70℃保存备用。1.2.2鸡新城疫病毒抗原表位合成肽的溶解与保存根据鸡新城疫病毒HN蛋白表面抗原结构，分段合成了13条多肽序列，用无菌的蒸馏水或去离子水或无氧水溶解冻干多肽，溶解多肽的浓度一般为1mg/mL。溶解后再用0.2μm孔径的滤膜过滤除菌，以防细菌降解。对于中性多肽，高度疏水时加入一定量的DMF或DMSO等膜变性剂有助于多肽的溶解。多肽溶液保存时要求多肽溶液的浓度一般在1mg/ml以上，避免反复冻融，包含Cys、Met、Trp、Glu、Asp的多肽易于氧化，须保存在无氧化剂的环境中，由于细菌能降解多肽，因此贮存前必须过滤除菌。1.2.3合成多肽与载体蛋白的连接将合成多肽偶联于载体蛋白BSA或KLH，以利于多肽的抗原性检测和多肽免疫。应用异型双功能试剂Sulfo-SMCC(MW:436.37，SpacerArmLength:Pierce)通过将载体蛋白BSA或KLH上的-NH2和多肽C末端Cys的-SH相连形成人工结合抗原多肽BSA-Pep或KLH-Pep。偶联步骤为：(1)称量4mgBSA或KLH溶于500μL偶联缓冲液(0.1mol/Lphosphate，0.15mol/LNaCl，含1μmol/LEDTA，pH7.2)；(2)加入1mgSulfo-SMCC于载体蛋白溶液；(3)RT孵育60min或37℃孵育30min，并不时混匀；(4)对偶联缓冲液充分透析，以除去多余的偶联剂，此溶液即为Sulfo-SMCC活化的载体蛋白溶液，用偶联缓冲液调整蛋白浓度为5mg/mL；(5)取10μL(50μg)Sulfo-SMCC活化的载体蛋白，加入N末端含Cys的溶解多肽50μg，充分混匀，于4℃孵育4h或过夜，完成偶联反应，4℃保存备用。1.2.4Peptide-ELISA应用Peptide-ELISA方法检测合成多肽与鸡新城疫病毒抗血清的反应性。检测程序如下：(1)以包被缓冲液(0.1mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释BSA偶联多肽，1μg/mL，包被酶标板(50μL/孔)，4℃孵育过夜，PBST洗6次；(2)用含5％猪血清的PBST封闭酶标板，200μL/孔，RT孵育2h；(3)加入用5％猪血清PBST1:1000倍稀释的抗鸡IBDV单克隆抗体或鸡IBDV抗血清，50μL/孔，RT孵育30～60min，PBST洗6次；(4)加入工作浓度(1:1000)的兔抗鸡-IgG-HRP，50μL/孔，RT孵育30～60min，PBST洗6次；(5)加入HRP底物溶液和显色剂，各50μL/孔，RT孵育10min，显色观察结果，以50μL/孔的2mol/L硫酸溶液终止显色反应，在酶标仪上读取450nm吸光值。1.2.5敏感性将NDV标准血清，按照1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400倍比稀释，用合成的卡抗原表位多肽进行抗体ELISA检测，同时用NDV抗体商品化ELISA检测试剂盒，对以上血清进行检测。1.2.6特异性以NDV阳性抗体10份，NDV阴性抗体5份、禽流感病毒(AIV)抗体1份、鸡法氏囊病毒(IBDV)抗体1份，用PBS1:100稀释后，用筛选到的表位多肽进行抗体ELISA检测，5～10min后观察试纸检测结果。1.2.7临床样品检测收集不同地区疑是感染NDV病毒病鸡血清36份，用PBS1:100稀释后用筛选到的表位多肽进行抗体ELISA检测，同时用商品化ELISA试剂盒检测，对比两种方法的符合率。2.结果2.1Peptide-ELISA分别将合成的多肽偶联BSA后，ELISA反应结果显示只有多肽P24和P25与鸡新城疫阳性血清反应呈阳性。2.2敏感性通过检测倍比稀释的阳性NDV血清，检测合成多肽的敏感性。同时运用NDV抗体商品化ELISA试剂盒检测，结果表明阳性血清稀释到1:51200后，多肽P25仍然检测出阳性结果，而商品化的ELISA试剂盒判断为可疑，而多肽P24只能检测到血清稀释倍数为1:1600。2.2特异性试纸检测NDV阳性血清10份，NDV阴性血清5份、禽流感病毒(AIV)抗体1份、鸡法氏囊病毒(IBDV)抗体1份，用PBS1:100稀释后，多肽P25检测结果显示，能与NDV阳性血清反应，不与NDV阴性血清以及其他病毒感染的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡新城疫病毒抗原表位多肽制备方法，其特征在于其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种鸡新城疫病毒抗原表位多肽制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王选年，冯春花，李鹏，张艳芳，王利平，孙国鹏，岳锋，朱艳平，张万方，任鹏举，王亚平，王玲玲，武乐祎，
申请(专利权)人：新乡学院，
类型：发明
国别省市：河南,41