突变根霉属菌制造技术

本发明专利技术提供一种有机酸生产率高的根霉属菌，其为丙酮酸脱羧酶活性降低的突变根霉属菌。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】突变根霉属菌
本专利技术涉及突变根霉属菌，以及使用突变根霉属菌的有机酸的制造方法。
技术介绍
乳酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸等有机酸是在食品制造中使用，用作合成树脂或生物分解性聚合物的原料等工业的价值高的物质。近年来，进行使用微生物或酶的生物学有用物质的生产。然而，在使用微生物进行的物质的工业生产中，生产率的提高是重要的课题之一。为了提高生产率，过去通过突然变异等遗传学方法进行生产菌的育种。特别是最近伴随着微生物遗传学和生物工程技术的发展，使用基因重组技术等开发更高效率的微生物学的物质生产方法受到瞩目。例如专利文献1～3公开了使用导入有作为丝状菌的根霉菌属(Rhizopus)的启动子的微生物的乳酸生产法。此外，非专利文献1报道了富马酸生产量高，作为副产物的乙醇产生少的突变根霉属菌。此外，专利文献4和5报道了特定的条件下在真核生物或原核生物生产富马酸时，破坏丙酮酸脱羧酶基因或抑制丙酮酸脱羧酶的活性对提高富马酸生产率有贡献。然而，根霉属菌的遗传学背景尚未充分研究，现状是通过基因重组技术开发适合有用物质生产的根霉属菌并不容易。(专利文献1)美国专利第6268189号说明书(专利文献2)国际公开第2001/73083号(专利文献3)国际公开第2001/72967号(专利文献4)国际公开第2009/155382号(专利文献5)日本特开2005-211042号(非专利文献1)KoreanJChemEng,2010,27(1):183-186
技术实现思路
本专利技术提供一种丙酮酸脱羧酶的活性降低的突变根霉属菌。此外，本专利技术提供一种突变根霉属菌的制造方法，其中，包括降低根霉属菌中丙酮酸脱羧酶的活性。此外，本专利技术提供一种根霉属菌的有机酸生产率的提高方法，其中，包括降低根霉属菌中丙酮酸脱羧酶的活性。此外，本专利技术提供一种有机酸的制造方法，其中，包括培养上述突变根霉属菌。具体实施方式本说明书中引用的全部专利文献、非专利文献、以及其它出版物将其整体在本说明书中援引作为参考。本说明书中，核苷酸序列和氨基酸序列的同一性通过Lipman-Pearson法(Science,1985,227:1435-1441)计算。具体而言，使用基因信息处理软件Genetyx-Win的同源性解析(Searchhomology)程序，将Unitsizetocompare(ktup)设定为2，进行解析而算出。本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列相关的“至少80％同一性”是指80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、进一步优选为97％以上、此外优选为98％以上、此外进一步优选为99％以上的同一性。此外，本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列相关的“至少85％同一性”是指85％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、此外优选为98％以上、此外进一步优选为99％以上的同一性。本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列相关的“至少95％同一性”是指95％以上、优选为97％以上、更优选为98％以上、进一步优选为99％以上的同一性。本说明书中，作为“缺失、插入、取代或附加1个或多个氨基酸的氨基酸序列”，可以举出缺失、插入、取代或附加1个以上30个以下、优选为1个以上20个以下、更优选为1个以上10个以下、进一步优选为1个以上5个以下、此外优选为1个以上3个以下的氨基酸的氨基酸序列。此外，本说明书中，作为“缺失、插入、取代或附加1个或多个核苷酸的核苷酸序列”，可以举出缺失、插入、取代或附加1个以上90个以下、优选为1个以上60个以下、更优选为1个以上30个以下、进一步优选为1个以上15个以下、此外优选为1个以上10个以下的核苷酸的核苷酸序列。此外，本说明书中，氨基酸或核苷酸的“附加”包括对于序列的一个末端和两个末端附加1个或多个氨基酸或核苷酸。本说明书中，控制区域和基因的“可工作地连接”是指基因与控制区域以该基因在该控制区域的控制下可表达的方式进行连接。基因与控制区域的“可工作地连接”的步骤为本领域技术人员所公知的。本说明书中，除非特别限定，基因相关的“上游”和“下游”是指该基因的转录方向的上游和下游。本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列上的“相当的位置”或“相当的区域”可以通过以给予最大的相同性的方式使目标序列和参照序列(例如序列号11表示的氨基酸序列)进行比对(alignment)而确定。氨基酸序列或核苷酸序列的比对可以使用公知的算法而实行，其步骤是本领域技术人员所公知的。例如，就比对而言，可以基于上述的Lipman-Pearson法等通过手操作而进行，也可以通过在默认设置中使用ClustalW多重比对程序(Thompson,J.D.etal,1994,NucleicAcidsRes.22:4673-4680)而进行。或者，可以使用作为ClustalW修订版的ClustalW2或Clustalomega。ClustalW、ClustalW2以及Clustalomega例如可以在欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute：EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])、或国立遗传学研究所运营的日本DNA数据库(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])的网站上利用。通过上述的比对而对应于参照序列的任意的区域所匹配的目的序列的位置或区域在该任意的区域中被看作“相当的位置”或“相当的区域”。本说明书中，“pdc基因”为编码丙酮酸脱羧酶的基因，为从以下选择的基因：由序列号1表示的核苷酸序列构成的多聚核苷酸；由与序列号1表示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列构成的、并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；以及由相对于序列号1表示的核苷酸序列缺失、插入、取代或附加1个或多个核苷酸的核苷酸序列构成的、并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸。作为由序列号1表示的核苷酸序列构成的多聚核苷酸，可以列举编码来自戴尔根霉(Rhizopusdelemar)的丙酮酸脱羧酶1(PDC1)(序列号2)的基因。因此，本说明书中的“pdc基因”为从以下选择的基因：编码由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽的多聚核苷酸；编码由与序列号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列构成并且具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；编码由相对于序列号2表示的氨基酸序列缺失、插入、取代或附加1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列构成并且具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸。本说明书中，突变微生物的“丙酮酸脱羧酶活性降低”是指突变微生物中丙酮酸脱羧酶活性降低至突变前菌株(亲本株)的活性的50％以下，优选为20％以下，更优选为15％以下。微生物的丙酮酸脱羧酶活性能够按照后述实施例所记载的方法进行测定。本专利技术涉及提供一种有机酸生产率高的突变根霉属菌，以及使用该突变根霉属菌的有机酸的制造方法。本专利技术人研究了根霉属菌的有机酸生产率的提高。结果本专利技术人发现在丙酮酸脱羧酶的活性发生降低的根霉属菌中，有机酸生产率得到显著提高，由此完成本专利技术。本专利技术提供了一种有机酸生产率高的突变根霉属菌。根据本专利技术的突变根霉属菌，能够实现高效率的有机酸的微生物学生产。本专利技术的突变根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种突变根霉属菌，其中，pdc基因发生缺失或失活，该pdc基因为从以下选择的至少1个：由序列号1表示的核苷酸序列构成的多聚核苷酸；由与序列号1表示的核苷酸具有至少80％同一性的核苷酸序列构成的、并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；由相对于序列号1表示的核苷酸序列缺失、插入、取代或附加1个或多个核苷酸的核苷酸序列构成的、并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；编码由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽的多聚核苷酸；编码由与序列号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列构成并且具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；以及，编码由相对于序列号2表示的氨基酸序列缺失、插入、取代或附加1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列构成并且具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.04 JP 2016-0196761.一种突变根霉属菌，其中，pdc基因发生缺失或失活，该pdc基因为从以下选择的至少1个：由序列号1表示的核苷酸序列构成的多聚核苷酸；由与序列号1表示的核苷酸具有至少80％同一性的核苷酸序列构成的、并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；由相对于序列号1表示的核苷酸序列缺失、插入、取代或附加1个或多个核苷酸的核苷酸序列构成的、并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；编码由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽的多聚核苷酸；编码由与序列号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列构成并且具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；以及，编码由相对于序列号2表示的氨基酸序列缺失、插入、取代或附加1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列构成并且具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸。2.如权利要求1所述的突变根霉属菌，其中，丙酮酸脱羧酶的活性与突变前相比，降低至50％以下。3.如权利要求1或2所述的突变根霉属菌，其中，所述根霉属菌为米根霉或戴尔根霉。4.如权利要求1～3中任一项所述的突变根霉属菌，其中，有机酸生产率提高。5.如权利要求4所述的突变根霉属菌，其中，所述有机酸为富马酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸或α-酮戊二酸。6.一种突变根霉属菌的制造方法，其中，包括将根霉属菌中的pdc基因缺失或失活，该pdc基因为从以下选择的至少1个：由序列号1表示的核苷酸序列构成的多聚核苷酸；由与序列号1表示的核苷酸具有至少80％同一性的核苷酸序列构成的、并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；由相对于序列号1表示的核苷酸序列缺失、插入、取代或附加1个或多个核苷酸的核苷酸序列构成的、并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；编码由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽的多聚核苷酸；编码由与序列号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列构成并且具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；以及，编码由相对于序列号2表示的氨基酸序列缺失、插入、取代或附加1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列构成并且具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸。7.一种提高根霉属菌的有机酸生产率的方法，其中,包括将根霉属菌中的pdc基因缺失或失活，该pdc基因为从以下选择的至少1个：由序列号1表示的核苷酸序列构成的多聚核苷酸；由与序列号1表示的核苷酸具有至少80％同一性的核苷酸序列构成的、并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；由相对于序列号1表示的核苷酸序列缺失、插入、取代或附加1个或多个核苷酸的核苷酸序列构成的、并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；编码由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽的多聚核苷酸；编码由与序列号2表示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列构成并且具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸；以及，编码由相对于序列号2表示的氨基酸序列缺失、插入、取代或附加1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列构成并且具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多聚核苷酸。8.如权利要求4或5所述的方法，其中，所述pdc基因的缺失或失活通过使用人工DNA切断酶的pdc基因座的基因组编辑进行。9.如权利要求8所述的方法，其中，所述基因组编辑通过TALEN、Crispr-cas9系统或ZFN进行。10.如权利要求8所述的方法，其中，所述基因组编辑将TALEN肽、或编码TALEN肽的多聚核苷酸导入所述根霉属...

【专利技术属性】
技术研发人员：壶井雄一，
申请(专利权)人：花王株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP