本发明专利技术的技术问题在于提供可以实现搭载于载体的基因的瞬时高表达及在该表达后载体的快速除去等的经过改良的负链RNA病毒载体及其利用。本发明专利技术发现，通过向负链RNA病毒载体所具有的NP、P或L基因添加微RNA目标序列，导入细胞可以依赖于进行表达的微RNA来对载体的表达进行调控。特别是在向NP、或P基因添加了微RNA目标序列的情况下，依赖于微RNA载体的表达降低，并促进载体的除去，另一方面，在向L基因添加的情况下，效果逆转。本发明专利技术的载体可以用于细胞疗法及再生医疗，以及作为以癌症为靶向的治疗用载体很有用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经过改良的副粘病毒载体
本专利技术涉及经过改良的负链RNA病毒载体。更具体而言，涉及以向NP、P和/或L基因中添加微RNA目标序列的方式进行了修饰后的负链RNA病毒载体及其利用。
技术介绍
仙台病毒(SeV)载体等负链RNA病毒载体为细胞质型RNA病毒载体(表达的全部阶段在细胞质中进行的载体)，因此即使在体内使用，也完全无需担心搭载基因向宿主染色体整合而产生遗传毒性。另外，它具有可以在体外和体内两者获得高的基因导入、表达效率；及可以在体外长期持续表达等多种优异的性能。因此，SeV载体广泛在多能干细胞的制备、基因治疗/基因疫苗或者抗体产生及功能分析等应用中作为基因导入载体而采用及利用，例如(专利文献1、2；非专利文献1、2)。目前，报告有：通过缺陷SeV载体的P蛋白实现瞬时表达(专利文献3、非专利文献3)；通过向非复制型载体(专利文献4)、P蛋白或L蛋白插入温度敏感性突变和基于温度变动而除去SeV载体(专利文献1、2)；通过向L基因的3’非翻译区中添加miR-302a的目标序列或基于添加siRNA而除去SeV载体(专利文献5)。但是，P蛋白缺陷载体存在搭载基因表达低和表达时间短的技术问题(SeV载体的高表达能力受损)，而现有的温度敏感性突变载体存在除去所需时间较长(在39℃下培养数天)的技术问题。而实际上，具有向SeV载体的L基因的3’非翻译区添加微RNA目标序列的例子(专利文献5)，但不存在向SeV载体的NP基因或P基因添加微RNA目标序列的例子。现有技术文专利文献专利文献1：国际公开WO2010/008054专利文献2：国际公开WO2012/029770专利文献3：国际公开WO2008/133206专利文献4：国际公开WO2008/007581专利文献5：国际公开WO2012/063817非专利文献非专利文献1：BitzerM,etal.,JGeneMed.(2003)5,543-553非专利文献2：GriesenbachU,etal.,CurrOpinMolTher.(2005)7,346-352非专利文献3：AbeT,etal.ExpHematol.(2011)39,47-54
技术实现思路
专利技术想要解决的技术问题本专利技术的技术问题在于提供通过向负链RNA病毒的NP、P和/或L基因添加微RNA目标序列来调控载体表达的方法以及该载体及其利用。具体而言，本专利技术的技术问题在于提供向负链RNA病毒的NP基因和/或P基因添加了微RNA目标序列而成的负链RNA病毒载体、该载体的制造方法及其使用。另外，本专利技术提供通过向负链RNA病毒的NP基因和/或P基因添加微RNA目标序列来负调控载体表达的方法。另外，本专利技术还涉及促进载体除去的方法，该方法使用向负链RNA病毒的NP基因和/或P基因添加了微RNA目标序列而得到的负链RNA病毒载体。另外，本专利技术的技术问题在于提供向L基因添加了微RNA目标序列而得到的负链RNA病毒载体、该载体的制造方法及其使用。另外，本专利技术提供通过向负链RNA病毒的L基因添加微RNA目标序列来正调控载体表达的方法。用于解决技术问题的技术方案本专利技术人等探索了在维持负链RNA病毒载体的基因表达能力，并且改善载体除去速度的方法。为了使用负链RNA病毒载体进行瞬间表达，本专利技术人等最初尝试了使用P基因缺陷载体。但是，将制备的载体导入细胞中并观察报告蛋白的表达，发现，在不表达P蛋白的HeLa细胞中，没有确认到报告蛋白的表达。非专利文献3中也报道了，与没有发生P基因的缺陷的载体相比，来自P基因缺陷载体的搭载基因的表达为1/10以下。另外，专利文献4的非复制型SeV载体为了获得充分的基因表达量，需要存在高滴度或者辅助(helper)载体，生产效率也比较低。另一方面，就专利文献2中记载的载体(TS12骨架及TS15骨架)而言，通过在培养条件39℃下培养感染细胞7天，除去了SeV载体，但在37℃下除去则需要更长时间，例如，在诱导iPS细胞时，从SeV载体感染至获得碱性磷酸酶阳性菌落经过了28天。另外，虽然假设iPS细胞的细胞增殖较快，载体容易除去，但仍不能立刻除去载体，从而可以想到，在HeLa细胞等普通细胞株中，除去载体需要更长时间。另外，本专利技术人等也尝试了通过向P蛋白添加降解决定子(degron)来除去SeV载体(国际公开WO2016/125364)。在向温度敏感性P蛋白添加降解决定子(degron)而得到的载体中，可以实现比专利文献2中记载的载体更快地除去载体，但存在需要在比除去载体的温度更低的温度下使其感染(当在37℃下除去骨架的情况下，在32～35℃下进行感染)的技术问题。针对这样的技术问题，本专利技术人等者人认为可以通过向负链RNA病毒载体的病毒基因添加RNA目标序列来促进载体的除去。因此，本专利技术人等首先尝试了通过向负链RNA病毒载体的L基因添加RNA目标序列来除去载体，其中，L基因是负链RNA病毒载体的病毒蛋白中被认为最适合促进通过微RNA目标序列除去载体的基因。然而，向L基因添加RNA目标序列之后，在表达微RNA的细胞中，载体的表达反而上升，难以通过向L基因添加RNA目标序列来有效调控导入基因的表达及载体的除去。因此，本专利技术人等进行了向负链RNA病毒的P基因添加RNA目标序列的实验。结果发现，在向P基因的编码区或5’或者3’非翻译区添加了微RNA目标序列的情况下，在刚刚向微RNA非表达细胞导入载体之后，导入基因的表达可以实现极高水平，另一方面，在微RNA表达细胞中，发挥快速除去载体这一非常优异的性能。另外，在L基因的情况下，即使重复四次添加的微RNA目标序列，也不能获得降低导入基因的表达的效果，而在P基因的情况下，可以通过一个微RNA目标序列发挥效果。而且，与向NP基因添加微RNA目标序列而得到的载体相比，向P基因导入微RNA目标序列时，降低导入基因的表达的效果更高。对P基因的5’及3’非翻译区进行比较可知，3’端降低导入基因的表达的效果更高。而且，在搭载有两个P基因的载体中，成功地通过微RNA目标序列细胞特异性地使一个P蛋白的表达降低，通过温度敏感性或者降解决定子(degron)使另一个P蛋白的表达降低。通过搭载两个表达调控特性不同的P基因，获得了可以在37℃下感染，且通过微RNA目标序列及温度敏感性或者降解决定子(degron)的多个系统调控表达的载体。在iPS细胞中，通过多个微RNA确认了促进载体的除去。另外，还证明了，不仅iPS细胞，在用作中胚层模型的血管内皮细胞、用作内胚层模型的肝细胞、用作外胚层模型的神经细胞、用作正常细胞模型的BJ细胞中，搭载有进行特异性表达的微RNA的目标序列的载体在各个细胞中可以被除去。而且，进一步证明了，若向溶瘤病毒搭载在正常细胞中表达且在癌细胞中表达降低的微RNA的目标序列，则溶瘤病毒具有癌细胞选择性地进行增殖。即，可以实现：在作为iPS细胞材料的细胞中使搭载于载体上的转录因子等瞬间高表达，通过重编程之后表达的微RNA除去载体；在干细胞中使转录因子等瞬间高表达，通过分化诱导之后表达的微RNA除去载体；在溶瘤病毒中，抑制对正常细胞的影响，同时提高对癌细胞的选择性。因此，本专利技术的载体有望用作对于再生医疗或细胞疗法等中的细胞的性状修饰或者癌治疗等有用的基因表达载体。另外本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种修饰副粘病毒载体，其以添加微RNA目标序列的方式对该病毒的NP基因、P基因或L基因进行了修饰，其中，在表达该微RNA的细胞中，就向NP基因或P基因添加了微RNA目标序列而得到的载体而言，该载体的表达被负调控；就向L基因添加了微RNA目标序列而得到的载体而言，该载体的表达被正调控。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.13 JP 2015-2231331.一种修饰副粘病毒载体，其以添加微RNA目标序列的方式对该病毒的NP基因、P基因或L基因进行了修饰，其中，在表达该微RNA的细胞中，就向NP基因或P基因添加了微RNA目标序列而得到的载体而言，该载体的表达被负调控；就向L基因添加了微RNA目标序列而得到的载体而言，该载体的表达被正调控。2.根据权利要求1所述的载体，其中，至少一个包膜蛋白质基因发生缺陷。3.根据权利要求1或2所述的载体，其中，NP基因、P基因或L基因的翻译区、5’或3’非翻译区中添加有微RNA目标序列。4.根据权利要求1～3中任一项所述的载体，其中，副粘病毒为仙台病毒。5.根据权利要求1～4中任一项所述的载体，其包含温度敏感性突变。6.根据权利要求5所述的载体，其中，该温度敏感性突变包含P蛋白的L511F突变。7.根据权利要求5或6所述的载体，其中，该温度敏感性突变包含P蛋白的D433A、R434A及K437A。8.根据权利要求1～7中任一项所述的载体，其中，微RNA目标序列选自miR-122、miR-124、miR-126、miR-138、miR-143、miR-218、miR-302簇、miR-367及miR-372中的各个目标序列。9.根据权利要求1～8中任一项所述的载体，其搭载转录因子基因或自杀基因。10.一种用于促进除去副粘病毒载体的方法，其包括：使用权利要求1～9中任一项所述的载体，该载体为向NP基因或P基因中添加微RNA目标序列而成...
【专利技术属性】
技术研发人员：佐伯晃一，草野好司，原裕人，井上诚，川口实太郎，
申请(专利权)人：株式会社爱迪药业，
类型：发明
国别省市：日本,JP
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