通过在昆虫细胞中扩增遗传密码来制备工程化蛋白质的手段和方法技术

本发明专利技术涉及制备工程化靶多肽(TP)的方法，所述工程化靶多肽在其氨基酸序列中包含一个或多个相同或不同的非规范氨基酸(ncAA)残基，通过在昆虫细胞系(ICL)中表达所述TP并通过在所述ICL中表达新的正交细菌氨酰tRNA合成酶/tRNA对实现所述方法；适用于将所述正交tRNA合成酶/tRNA的遗传信息引入所述ILC的杆状病毒穿梭载体(杆粒)；用于在所述ILC中表达所述特定tRNA的特定表达盒；由所述方法获得的TP；以及制备所述TP的试剂盒。

Ways and means of preparing engineered proteins by amplifying genetic code in insect cells

The present invention relates to a method for preparing an engineered target polypeptide (TP). The engineered target polypeptide contains one or more identical or different non normal amino acid (ncAA) residues in its amino acid sequence, expressing the TP by means of the insect cell line (ICL) and expressing the new orthogonal bacteria aminoyl tRNA synthetase /tRNA by the ICL in the ICL. The present method is suitable for introducing the genetic information of the orthogonal tRNA synthetase /tRNA into the baculovirus shuttle vector (rod) of the ILC, for expressing the specific expression box of the specific tRNA in the ILC, the TP obtained by the method, and the kit for preparing the TP.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过在昆虫细胞中扩增遗传密码来制备工程化蛋白质的手段和方法
本专利技术涉及通过在昆虫细胞系(ICL)中表达工程化靶多肽(TP)并通过在所述ICL中表达新的正交细菌氨酰tRNA合成酶/tRNA对来制备在其氨基酸序列中包含一个或多个相同或不同的非规范氨基酸(ncAA)残基的靶多肽(TP)的方法；适于将所述正交tRNA合成酶/tRNA的遗传信息导入所述ILC的杆状病毒穿梭载体(杆粒)；用于在所述ILC中表达所述特定tRNA的特定表达盒；由所述方法获得的TP；以及用于制备所述TP的试剂盒。
技术介绍
非规范氨基酸(ncAA)的掺入是大肠杆菌和真核细胞中蛋白质功能化的主要工具。遗传密码扩增自数十年开始使用，同时在大肠杆菌以及真核系统如哺乳动物(Chatterjee等人，PNAS2013,110,29：11803-11808)、酵母(Chin,J.W.,Cropp,T.A.,Anderson,J.C.,Mukherji,M.,Zhang,Z.,和Schultz,P.G.(2003)..Science301,964-967)或黑腹果蝇(Mukai，T等人，ProteinScience2010,19：440-448)中良好建立。该系统用于将非规范氨基酸(ncAA)位点特异性掺入到蛋白质中。应用带有各种官能团的非规范氨基酸的引入，例如，用于单分子研究或超分辨率显微术的蛋白质标记，蛋白质交联或附着选择的翻译后修饰。为此目的，合成酶/tRNA对(其与表达宿主正交)必须与目的蛋白质共转染。合成酶可以响应琥珀终止密码子识别非规范氨基酸，其将被插入延长的蛋白质链中。已经存在若干系统，例如詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)TyrRS/tRNATyr或马氏甲烷八叠球菌PylRS/tRNAPyl(Liu，C.C.和Schultz，P.G.(2010).Annualreviewofbiochemistry79,413-444。琥珀终止密码子UAG已成功用于体外生物合成系统和爪蟾卵母细胞中，以指导非天然氨基酸的掺入。在三种终止密码子中，UAG是大肠杆菌中使用最少的终止密码子。一些大肠杆菌菌株含有天然抑制子tRNA，其识别UAG并插入天然氨基酸。另外，这些琥珀抑制子tRNA已被用于常规蛋白质诱变。在大肠杆菌中，小和中等大小的蛋白质可以很容易地大量表达。然而，这种简单的实验室宿主不适合表达具有理想的天然真核翻译后蛋白质修饰的大型多蛋白复合物。为了高分子量蛋白质或蛋白质复合物，尤其是源自真核生物的蛋白质复合物的表达，优选其他表达宿主，例如哺乳动物培养物。除了大小限制外，大肠杆菌表达的蛋白质中也不存在大多数翻译后修饰。Mukai等人(参见上文)开发了一种用于将ncAAs掺入到蛋白质中特定位点的基于黑腹果蝇Schneider2-细胞的系统。在S2细胞中构建并检测了包含原核tRNATyr的不同表达系统。包含在黑腹果蝇U6启动子No.2控制下的大肠杆菌tRNATyr的被称为U6-EYR的表达系统效果最好。携带3个拷贝的U6-EYR和对3-碘代-L-酪氨酸特异性的大肠杆菌TyrRS的编码序列的质粒载体用于稳定转染S2细胞。此外，Chin等人已经类似地表明甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)吡咯赖氨酸tRNA/RS对可以用于果蝇细胞和动物(Bianco,A.,Townsley,F.M.,Greiss,S.,Lang,K.,和Chin,J.W.(2012).r.Naturechemicalbiology8,748-750以及Elliott,T.S.,Townsley,F.M.,Bianco,A.,Ernst,R.J.,Sachdeva,A.,Elsasser,S.J.,Davis,L.,Lang,K.,Pisa,R.,Greiss,S.等人，(2014)..Naturebiotechnology32,465-472)。然而，如上所述的现有技术中描述的工程化蛋白的真核蛋白表达仍不令人满意。因此，本专利技术要解决的问题是开发新的方法和工具，其允许在昆虫细胞系中适当加工的真核蛋白质或在其序列内携带非规范氨基酸残基的多种蛋白质的成本有效的大规模表达，从而可以实现表达蛋白的翻译后修饰。
技术实现思路
通过在昆虫细胞系，特别是Sf21细胞中建立遗传密码扩增，结合改进的杆状病毒载体，出人意料地解决了本专利技术的问题。特别是，专利技术人将正交合成酶PylRS/tRNA对改组为广泛使用的杆粒载体，导致新的DH10Bac-TAG细胞。特别是，应用了MultiBac系统，其是多功能平台，可以轻松生成大型蛋白质组装体并在真核生物中表达它们。通过所述方法，专利技术人成功地将ncAA引入绿色荧光蛋白(GFP)以及许多不同的多蛋白复合物中。附图简述图1示出了来自各种生物体(智人、黑腹果蝇、草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)和家蚕(Bombyxmori))的snRNAU6基因(SEQIDNO:10-14)。来自人类和果蝇的snRNA基因以及snRNAU6同种型E是从genBank中提取的。对于草地贪夜蛾和示出的第一个家蚕snRNA，序列从基因组序列中取出。所有基因彼此高度相似，只有很小比例的核苷酸是不同的(通过下划线突出显示)。此外，序列长度相等，仅snRNAU6家蚕同种型E在N末端(5'端)缺失15个核苷酸并且在C末端(3'端)具有13个核苷酸加多聚T尾巴。图2示出了与U6启动子、snRNAU6和家蚕的3'终止序列比对的snRNAU6基因(通过下划线突出)和草地贪夜蛾的相应的上游U6启动子区域和相应的下游3'终止信号的比对。使用ClustalW(Larkin,M.A.等人，ClustalWandClustalXversion2.0.Bioinformatics23,2947-2948(2007).Goujon,M.等人，AnewbioinformaticsanalysistoolsframeworkatEMBL-EBI.Nucleicacidsresearch38,W695-699(2010))完成的比对示出snRNAU6基因是非常保守的。启动子区域看起来相似，特别是在接近snRNA基因的区域，3'终止信号也是如此。只有U6-1和U6-3序列与其他序列相比显示出较高程度的错误比对。图3示出了不同的tRNAPyl构建体和用这些构建体转染的Sf21细胞的FACS结果。A：绘示了不同生物体(人、果蝇、家蚕和夜蛾)的U6启动子序列，其在来自马氏甲烷八叠球菌的tRNAPyl基因的上游，随后是每个snRNAU6基因的相应下游3'终止信号。B：用不同U6-tRNA构建体和报告子构建体(pIZT-PylRSWT-mCherry-GFP(TAG)(图3B-1至3B-4)转染的Sf21细胞的FACS结果。每个分析通过三个图表示。右上角示出了散射数据和选定的门，其中包含活细胞，以黑色的椭圆标记。在右下角图中，用黑色椭圆选择单细胞。最终的数据在左图中示出，它被分成四个门。左上角门示出细胞的数据点，其仅表示mCherry(仅mCherry)，左下角门示出细胞，既不表示mCherry也不表示GFP(双阴性)。右下角门仅包含GFP表达细胞的细胞计数(仅GFP)。在右上角本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备在其氨基酸序列中包含一个或多个相同或不同的非规范氨基酸(ncAA)残基的靶多肽(TP)的方法，所述方法包括以下步骤：a)在所述一个或多个ncAA存在下，在昆虫细胞系(ICL)中表达所述TP，其中所述TP编码核苷酸序列(CSTP)包含编码所述一个或多个ncAA残基的一个或多个选择密码子；并以任何顺序并发或顺序进行b)在所述ICL中表达在所述TP的氨基酸序列中引入所述一个或多个ncAA残基所需的一种或多种正交细菌氨酰tRNA合成酶/tRNAncAA(O‑RS/O‑tRNAncAA)对，其中用于所述一种或多种细菌tRNAncAA(CStRNAncAA)的编码序列处于昆虫细胞来源的调控序列(RSIC)的控制下；和c)任选地回收表达的TP。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.30 EP 15197057.11.一种制备在其氨基酸序列中包含一个或多个相同或不同的非规范氨基酸(ncAA)残基的靶多肽(TP)的方法，所述方法包括以下步骤：a)在所述一个或多个ncAA存在下，在昆虫细胞系(ICL)中表达所述TP，其中所述TP编码核苷酸序列(CSTP)包含编码所述一个或多个ncAA残基的一个或多个选择密码子；并以任何顺序并发或顺序进行b)在所述ICL中表达在所述TP的氨基酸序列中引入所述一个或多个ncAA残基所需的一种或多种正交细菌氨酰tRNA合成酶/tRNAncAA(O-RS/O-tRNAncAA)对，其中用于所述一种或多种细菌tRNAncAA(CStRNAncAA)的编码序列处于昆虫细胞来源的调控序列(RSIC)的控制下；和c)任选地回收表达的TP。2.权利要求1所述的方法，其中所述ICL用携带表达所述TP和所述一种或多种O-RS/O-tRNAncAA对所需的遗传信息的一种或多种杆状病毒载体转染或转导。3.权利要求1所述的方法，其中所述RSIC选自a)昆虫snRNAU6基因的调控序列，和b)昆虫tRNA基因的调控序列，特别是H1调控序列。4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RSIC包含U6启动子，其中所述U6启动子选自对应于以下核苷酸残基的核苷酸序列a)SEQIDNO:1的1至400b)SEQIDNO:2的1至392c)SEQIDNO:3至8的1至385d)其功能片段，所述功能片段包含a)至c)中定义的任一核苷酸序列的部分序列。5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ICL选自灰翅夜蛾属细胞系，特别是草地贪夜蛾细胞系，优选Sf21(DSMZNr.ACC119)；或果蝇属细胞系，特别是黑腹果蝇细胞系，优选Schneider-2R+(果蝇基因组学研究中心(DGRC)货号150)。6.一种杆状病毒载体，其包含一种或多种正交细菌氨酰tRNA合成酶/tRNAncAA(O-RS/O-tRNAncAA)对的编码序列，其中所述细菌tRNAncAA编码序列(CStRNAncAA)置于昆虫-细胞来源的调控序列(RSIC)的控制下。7.权利要求6所述的载体，其中所述RSIC包含U6启动子，其中所述U6启动子选自对应于以下核苷酸残基的核苷酸序列a)SEQIDNO:1的1至400b)SEQIDNO:2的1至392c)SEQIDNO:3至8的1至385d)其功能片段，所述功能片段包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·伯格，E·莱姆克，C·克勒，G·埃斯特拉达吉罗纳，
申请(专利权)人：欧洲分子生物学实验室，
类型：发明
国别省市：德国,DE