人血清来源的IgG 多克隆抗体的分离剂、以及使用其的人血清来源的IgG 多克隆抗体的分离方法技术

本发明专利技术的课题在于提供人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂。该课题可通过人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂而解决，所述分离剂包含载体、和通过化学键而键合于载体的表面的单链抗体，该单链抗体对于人血清来源的IgG多克隆抗体具有3.0×10‑8M以下的解离常数。

Isolation of human serum-derived IgG polyclonal antibodies and methods for isolation of human serum-derived IgG polyclonal antibodies

The subject of the invention is to provide a separating agent for IgG polyclonal antibody from human serum. The subject can be solved by the separation agent of IgG polyclonal antibody from human serum, which contains the carrier and the single chain antibody on the surface of the carrier through the chemical bonds. The single chain antibody has the dissociation constant of the human serum IgG polyclonal antibody below 3 * 10.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂、以及使用其的人血清来源的IgG多克隆抗体的分离方法
本专利技术涉及单链抗体的筛选方法及单链抗体。
技术介绍
作为分子靶向药物的形态，已研究/开发了各种形态：以抗体医药品、低分子医药品为首的肽医药品、细胞因子等活体内蛋白制剂，以及除此以外的siRNA、适体等(例如，专利文献1)。就抗体的作为治疗药的用途而言，从其特异性方面考虑，对于疾病细胞表达特异性抗原的病情的治疗是有用的。抗体将在细胞表面表达的蛋白质作为抗原而结合，从而有效地作用于所结合的细胞。抗体具有血中半衰期长、对抗原的特异性高这样的特征，作为抗肿瘤剂也是非常有用的。作为获得这样的抗体的方法，已知有通过进行使用抗体文库的淘选(模拟了“从砂中淘出砂金”的过程而称为“淘选”)而获得抗体的技术。例如，已知有将人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)，通过噬菌体展示法使其在噬菌体的表面表达，从而选择与抗原结合的噬菌体的方法。如果对所选择的噬菌体的基因加以解析，则可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。如果明确了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可以将该序列组装于适当的表达载体，从而容易地制造人抗体(例如，专利文献2、3)。像这样，已知有基于使用抗体文库的淘选来获得作为抗体药物的候选的抗体的方法等。但是，在该
，在使抗原和噬菌体结合时，通常要将抗原固定于聚苯乙烯制的管、板，有时需要阻断(blocking)的操作、或导致吸附于管等的蛋白质发生变性。其结果，存在以下问题：在噬菌体文库中，产生与用于阻断的蛋白质、发生了变性的蛋白质结合的那些，导致获得了与目标抗原以外的抗原结合的噬菌体。另一方面，与上述抗体的获得方法相反地，开发了使用多层脂质体从肽文库获得与特定的抗体结合的肽的方法(非专利文献1)。在该文献中，作为模型，在对于固定于多层脂质体的抗八肽(FVNQHLCK，序列号35)抗体适用通过噬菌体展示法而在噬菌体的表面表达的肽的文库时，确认到可选择性地获得八肽(FVNQHLCK，序列号35)。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2015-145366号公报专利文献2：日本特开2015-097496号公报专利文献3：日本特表平9-506508号公报非专利文献非专利文献1：JournalofChromatographyA,1080(2005)22-28
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的课题在于提供分离效率优异、与抗原的结合能力极大的单链抗体的筛选方法，以及通过该筛选法获得的单链抗体。解决问题的方法本专利技术人发现：在使用通过噬菌体展示法制备的抗体文库经淘选而获得目标的抗体时，可以利用将抗原与多层脂质体结合这样的方法来解决以往那样的在使用将抗原固定于管等的方法的情况下所产生的容易获得与目标抗原以外的抗原结合的噬菌体的问题。本专利技术如下所述。[1]与抗原结合的单链抗体的筛选方法，其包括：准备结合于多层脂质体的抗原的工序、准备展示单链抗体的噬菌体文库的工序、及从上述噬菌体文库选择展示与上述结合于多层脂质体的抗原结合的单链抗体的噬菌体的工序。[2]根据[1]所述的方法，其中，上述单链抗体是兔来源单链抗体。[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，上述抗原为蛋白质。[4]根据[3]所述的方法，其中，上述蛋白质为抗体。[5]根据[4]所述的方法，其中，上述抗体为人血清来源的IgG多克隆抗体或人血清来源的IgA多克隆抗体。[6]根据[4]或[5]所述的方法，其中，上述单链抗体为与人来源抗体的L链结合的单链抗体。[7]抗体的制造方法，其包括：通过[1]～[6]中任一项所述的筛选方法进行筛选的工序，确定所筛选的单链抗体的氨基酸序列的工序，基于所确定的氨基酸序列的可变区的序列而制作编码抗体的DNA序列的工序、及使制成的DNA序列在宿主细胞中表达的工序。[8]根据[7]所述的制造方法，其中，编码抗体的DNA序列编码人源化抗体。[9]对于人血清来源的IgG多克隆抗体具有3.0×10-8M以下的解离常数的单链抗体。[10]根据[9]所述的单链抗体，其进一步与人血清来源的IgA多克隆抗体结合。[11]对于人血清来源的IgA多克隆抗体具有1.0×10-3s-1以下的解离速率常数的单链抗体。[12]对于人来源抗体的L链具有1.0×10-3s-1以下的解离速率常数的单链抗体。专利技术的效果根据本专利技术，可提供分离效率优异、与抗原的结合能力极大的单链抗体的筛选方法，以及通过该筛选法获得的单链抗体。由于多层脂质体的分散性良好，因此与传统方法相比，能够使结合于多层脂质体的抗原与抗体的接触有效地进行，还能够通过离心分离而简便地回收。另外，如果使用多层脂质体，则非特异性地吸附于载体的噬菌体会变得极少。进一步，由于抗原可以在多层脂质体的膜上横向扩散，因此与噬菌体文库的结合性大、分离效率优异，可以获得与抗原的结合能力极大的单链抗体。附图说明[图1]示出了实施例1-1、实施例1-2、比较例1-1、比较例1-2中获得的阳性克隆数相对于克隆数的比例的图。[图2]示出了实施例2及比较例2中的淘选前、第1轮结束时、第2轮结束时、第3轮结束时的噬菌体数的图。[图3]示出了用实施例2及比较例2中的第1轮结束时、第2轮结束时、第3轮结束时的各噬菌体数分别除以淘选前的噬菌体数而得到的回收率(％)的图。[图4]示出了在实施例2的淘选前、第1轮结束时、第2轮结束时、第3轮结束时以得到的含噬菌粒的大肠杆菌颗粒单元进行抗原结合活性评价时在波长450nm(副波长650nm)下的吸光度的图。[图5]示出了针对由实施例3-2中第1轮结束时所得到的48个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。[图6]示出了针对由实施例3-2中第2轮结束时所得到的48个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。[图7-1]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。[图7-2]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。[图7-3]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。[图7-4]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。[图7-5]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。[图7-6]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。[图7-7]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。[图7-8]示出了针对由实施例3-2中第3轮结束时所得到的96个菌落得到的兔来源单链抗体进行的抗原结合活性评价的结果的图。[图8-1]示出了在实施例5中确定的兔来源单链抗体基因的氨基酸序列。[图8-2]示出了在实施例5中确定的兔来源单链抗体基因的氨基酸序列。[图9-1]示出了实施例6及比较例6-1的抗原结合活性评价的结果的图。[本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂，其包含载体、和通过化学键而键合于载体的表面的单链抗体，该单链抗体对于人血清来源的IgG多克隆抗体具有3.0×10‑8M以下的解离常数。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.09 JP 2015-219765;2016.02.10 JP 2016-024011.人血清来源的IgG多克隆抗体的分离剂，其包含载体、和通过化学键而键合于载体的表面的单链抗体，该单链抗体对于人血清来源的IgG多克隆抗体具有3.0×10-8M以下的解离常数。2.根据权利要求1所述的分离剂，其中，所述单链抗体进一步为针对人血清来源的IgA多克隆抗体的抗体。3.根据权利要求2所述的分离剂，其中，所述单链抗体对于所述人血清来源的IgA多克隆抗体具有1.0×10-3s-1以下的解离速率常数。4.根据权利要求1～3中任一项所述的分离剂，其中，所述单链抗体为与L链结合的抗体。5.根据权利要求1～4中...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊田阳一，长谷川祐也，内村诚一，
申请(专利权)人：国立大学法人京都工艺纤维大学，株式会社大赛璐，
类型：发明
国别省市：日本,JP