通过适体介导的多腺苷酸化调节来外源性控制哺乳动物基因表达制造技术

本公开的实施方案涉及表达构建体的用途，其中至少一个polyA信号嵌入可表达的转录物的上游，例如，诸如在转录物的5'UTR内。在某些实施方案中，polyA信号包含在配体‑结合适体内，并且配体与适体的结合或其缺乏指示可表达的转录物的结果。在特定的实施方案中，配体的不存在导致在其5'UTR中具有polyA的表达的转录物被表达，但然后被降解，而配体的存在导致可表达的转录物在表达后的降解被抑制。在同一表达构建体上可存在多于一个配体‑结合适体。

Exogenous control of mammalian gene expression by aptamer mediated polyadenylation regulation

The present embodiment of the present disclosure relates to the use of an expression of a building in which at least one of the polyA signals is embedded in the upstream of the expressed transcript, for example, in the 5'UTR of the transcript. In some implementations, the polyA signal is included in the ligand binding to the body, and the binding of the ligand to the aptamer, or its lack of indication of the expression of the transcriptional substance. In a specific implementation, the absence of the ligand leads to the expression of the expression of polyA in its 5'UTR, but then degraded, and the presence of the ligand leads to the inhibition of the degradation of the expressed transcript after the expression. There are more than one ligand binding aptamer on the same expression construct.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过适体介导的多腺苷酸化调节来外源性控制哺乳动物基因表达本申请要求于2015年11月12日提交的美国临时专利申请序列第62/254,435号的优先权，所述专利申请通过引用整体并入本文。关于联邦政府资助的研究或开发的声明本专利技术是在国立卫生研究院授予的第1RO1EB013584-02号下由政府资助完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。
本公开的实施方案至少涉及细胞生物学、分子生物学、基因调节、基因疗法、干细胞疗法、医学、分子成像、生物传感器和诊断学。专利技术背景为了阐明特定基因产物的功能或在安全范围内生成治疗性蛋白质，精确控制转基因表达的能力一直是不可或缺的。目前有几种基因调节系统可用1-3，它们已被证明是非常强大的实验工具。然而，尽管它们具有实用性，但这些系统由于它们依赖于杂合转录反式激活因子和专门的启动子而具有一些实际限制。这些限制包括：(i)需要具有两个转录单元，一个用于表达反式激活因子，另一个用于表达要被调节的转基因。因此，使用这些系统需要共同引入两种表达构建体。(ii)来自杂合反式激活因子表达的潜在毒性(例如诱导针对作为外来蛋白的反式激活因子的宿主免疫应答，反式激活因子对内源性转录的作用等)。(iii)由于需要专门的启动子，因此难以将此类系统以组织特异性方式用于调节。(iv)有限数量的可用于实验和治疗性应用的小诱导物分子(由于有限数量的可用系统)。这些限制可以通过基因调节系统来克服，所述基因调节系统包含RNA，基本上由RNA组成或仅由RNA组成，所述基因调节系统不涉及任何反式激活蛋白和专门的启动子。已经报告了用于控制基因表达的完全基于RNA的机制的存在。具体地，已经描述了基于自催化核酶的调节的系统4，为开发只有RNA的系统提供了令人信服的合理性，所述系统在基因疗法和生物学研究中具有更广泛得多的应用。与基于使用反式激活因子控制转录的基因调节系统相反，本文提供的基于polyA的系统不需要任何蛋白反式激活因子产物的表达，并且不依赖于任何专门的启动子元件的使用，因此在理论上代表一种‘便携式’调节系统，其可被‘嵌入’任何内源基因或工程化的载体转录单元。因此，该系统只需要一个转录单元(一个表达构建体)，并且是启动子灵活性的，以便其可用于以组织特异性(空间)和时间方式调节转基因。因为多腺苷酸化是所有哺乳动物细胞中发生的普遍过程，因此所描述的系统是广泛适用的。由于现有技术的限制，尚未充分利用的基因调节的另一个重要应用领域是使用基因调节系统作为生物传感器用于体内检测特定细胞蛋白质表达或病理事件的能力。此类生物传感器平台可以提供关于生物分子水平波动的体内时间和空间信息，并且输入信息可用于调节细胞行为或生成用于成像或检测的报告信号。例如，基因调节系统可以与作为其配体的致癌蛋白质结合，并作为响应打开或关闭一组特定的基因。这些基因可生成用于定量检测或成像的报告信号，影响代谢途径的过程或表达治疗性蛋白质。特定细胞蛋白质的分子传感将允许显示活细胞中疾病背后的生化异常。此类技术可用于通过监测特定标志物蛋白的表达来监测临床治疗的进展，并且在具体的实施方案中，形成使得能够测试和开发新的治疗范例的重要平台。此外，此类技术可用于理解特定基因产物在生物过程和疾病发展中的作用。现代蛋白质组学技术已经提供了用于使内源性细胞蛋白质可视化或鉴定所述蛋白质的几种有用的方法。方法诸如质谱法5允许鉴定哺乳动物细胞或组织中存在的数百种蛋白质分子。然而，这些方法在该过程中破坏了细胞和组织，并且与旨在检测活动物或人中的特定细胞蛋白质的目标不相容。使用具有缀合的信号生成基序的抗体的方法虽然对于使细胞膜外的特定蛋白质可视化是有效的，但不适用于检测构成活细胞内大部分表达的蛋白质的细胞内蛋白质或对所述细胞内蛋白质进行成像。缺乏检测体内特定天然蛋白质的有用方法表明需要新的生物传感策略，因为它们将在理解基本生物学过程和疾病状态方面产生重大影响。本公开满足了本领域中对提供用于使用基于RNA开关的方法来检测天然蛋白质的表达以及调节活细胞中的目标基因的方法以及系统和组合物的长期需要。专利技术概述本公开的实施方案涉及使用适体介导的多腺苷酸化调节对基因调节进行的外源控制。本公开的实施方案涉及通过调节由配体对包含polyA信号的适体的结合的看门者作用控制的polyA切割来控制哺乳动物基因表达。本公开的实施方案涉及使用适体介导的多腺苷酸化调节来控制特定多核苷酸表达的分子开关。在具体的实施方案中，所述分子开关是基于5'UTRpolyA信号的RNA开关(其在本文中可被称为polyA开关或polyA传感器)。在具体的实施方案中，本公开的系统被用作生物传感器系统，其检测活细胞、组织或生物体中的一个或多个细胞内“标记”。“标记”可以反映所述的一种或多种基因的表达；一种或多种内源性产生的化合物诸如蛋白质或代谢物的存在或不存在；指示疾病状态或正常状态或治疗功效或其组合的分子的存在或不存在；等等。所述系统可以指示一种或多种细胞或组织或生物体的代谢或生理状态。在具体的实施方案中，所述系统包含多核苷酸，所述多核苷酸以5'至3'方向包含一个或多个在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；和可表达的多核苷酸；将系统暴露于合适的条件下，使得当配体不存在于系统或其环境中时，或配体不结合所述配体-结合适体时，来自可表达的多核苷酸的mRNA被降解。在一些实施方案中，系统经历合适的条件，使得当配体-结合适体时，来自可表达的多核苷酸的mRNA不被降解，并且基因产物可由可表达的多核苷酸表达。在某些实施方案中，本公开的系统涉及调节所述一个或多个讨论的特定基因的表达的能力。所述系统允许通过使用能够抑制基于5’UTRpolyA信号的RNA开关，从而导致基因的表达的特定配体来操纵基因的表达。所述系统允许使用配体诸如小分子定制基因表达来控制表达，包括例如以组织特异性和/或时间特异性的方式。在具体的实施方案中，所述系统充当生物传感器系统，用于使用定制的适体/可表达的多核苷酸组合来提供关于内源性配体在特定环境中的信息。在一个实施方案中，存在用于调节基因表达的系统，其包含多核苷酸，所述多核苷酸以5'至3'方向包含：a)至少一个各自在其中包含至少一个polyA切割信号(尽管在备选实施方案并非所有适体都具有polyA切割信号)的配体-结合适体；和b)可表达的多核苷酸。在特定的实施方案中，包含polyA切割信号的配体结合适体位于可表达的多核苷酸的5'非翻译区内。在特定的实施方案中，所述系统包含表达配体的多核苷酸。在一些方面，表达配体的多核苷酸是包含适体和可表达的多核苷酸的相同多核苷酸。在其它情况下，表达配体的多核苷酸是与包含适体和可表达的多核苷酸的多核苷酸不同的多核苷酸。在某些实施方案中，本公开内容涵盖的多核苷酸在可表达的多核苷酸的5’UTR中包含两个、三个或更多个polyA信号。在特定的实施方案中，多核苷酸包含：a)至少一个polyA信号；b)配体-结合适体；以及c)至少一个富含U/UG的区域，至少一个富含G的区域，或至少一个富含U/UG的区域和至少一个富含G的区域两者。在所述系统的一些实施方案中，配体-结合适体包含一个、两个、三个或更多个富含U/UG的区域。在某些方面，在多核苷酸的5'至3'方向上，至少一个pol本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调节基因表达的系统，所述系统包含polyA适体多核苷酸，所述多核苷酸以5'至3'方向包含：a)至少一个在其中包含至少一个polyA切割信号的配体‑结合适体；和b)可表达的多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.12 US 62/254,4351.一种调节基因表达的系统，所述系统包含polyA适体多核苷酸，所述多核苷酸以5'至3'方向包含：a)至少一个在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；和b)可表达的多核苷酸。2.根据权利要求1所述的系统，其中所述包含所述polyA切割信号的配体结合适体位于所述可表达的多核苷酸的5'非翻译区内。3.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述系统包含表达所述配体的多核苷酸。4.根据权利要求3所述的系统，其中表达所述配体的所述多核苷酸是包含所述适体和可表达的多核苷酸的所述相同polyA适体多核苷酸。5.根据权利要求3所述的系统，其中表达所述配体的所述多核苷酸是与包含所述适体和可表达的多核苷酸的所述polyA适体多核苷酸不同的多核苷酸。6.根据权利要求3-6中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸在所述可表达的多核苷酸的5'UTR中包含两个、三个或更多个polyA信号。7.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸包含：a)至少一个polyA信号；b)至少一个包含所述至少一个polyA信号的配体-结合适体；和c)至少一个富含U/UG的区域，至少一个富含G的区域，或至少一个富含U/UG的区域和至少一个富含G的区域两者。8.根据权利要求7所述的系统，其中所述配体-结合适体包含一个、两个、三个或更多个富含U/UG的区域。9.根据权利要求7所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，至少一个polyA信号位于至少一个富含U/UG的区域的上游。10.根据权利要求7所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，所述配体-结合适体位于一个、两个或更多个富含U/UG的区域的上游。11.根据权利要求7所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，至少一个polyA信号位于至少一个富含G的区域的上游。12.根据权利要求3所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，所述配体-结合适体位于一个、两个或更多个富含G的区域的上游。13.根据权利要求1-12中任一项所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，所述适体包含两个polyA信号和两个富含U/UG的区域。14.根据权利要求1-13中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸包含2个、3个、4个、5个或更多个适体。15.根据权利要求14所述的系统，其中第一适体和第二适体在5’至3’线性方向上处于相同的取向。16.根据权利要求14所述的系统，其中第一适体和第二适体在5’至3’线性方向上处于不同的取向。17.根据权利要求14-16中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸包含一个富含G的区域。18.根据权利要求17所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，所述富含G的区域在所述最3'适体中。19.根据权利要求17所述的系统，其中在所述polyA适体多核苷酸的5'至3'方向上，所述富含G的区域在所述第二适体中。20.根据权利要求14-19中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸不包含两个或更多个适体之间的碱基配对。21.根据权利要求14-19中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸包含两个或更多个适体之间的碱基配对。22.根据权利要求14-21中任一项所述的系统，其中在来自所述polyA适体多核苷酸中的两个不同适体的环的至少一部分之间存在碱基配对。23.根据权利要求1-22中任一项所述的系统，其中适体内的两个环之间的核苷酸数量为10-25个核苷酸。24.根据权利要求1-22中任一项所述的系统，其中适体内的两个环之间的核苷酸数量为18-20个核苷酸。25.根据权利要求1-24中任一项所述的系统，其中所述配体是多肽、肽、核酸、小分子、药物、代谢物或其组合。26.根据权利要求1-25中任一项所述的系统，其中适体的长度为14至250个核苷酸。27.根据权利要求1-26中任一项所述的系统，其中所述可表达的多核苷酸是报告基因、治疗性基因或基因产物改变所述细胞的代谢状态的基因。28.根据权利要求1-27中任一项所述的系统，其中所述polyA适体多核苷酸为载体的至少一部分。29.根据权利要求3所述的系统，其中表达所述配体的所述多核苷酸为载体的至少一部分。30.根据权利要求28或29所述的系统，其中所述载体是质粒、病毒载体或线性DNA。31.根据权利要求1-30中任一项所述的系统，其中所述可表达的多核苷酸编码所述配体。32.根据权利要求1-31中任一项所述的系统，其中所述可表达的多核苷酸的表达由组织特异性启动子调节。33.一种调节基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供系统，所述系统包含polyA适体多核苷酸，所述多核苷酸以5’至3’方向包含：1)至少一个在其中包含至少一个polyA切割信号的配体-结合适体；2)可表达的多核苷酸；和3)任选的配体-表达构建体；和b)使所述系统经受合适的条件，其中当不希望来自所述可表达的多核苷酸的mRNA时，所述配体不结合所述配体-结合适体或不存在于所述系统或其环境中，来自所述可表达的多核苷酸的mRNA被降解；或c)使包含所述配体-表达构建体的所述系统经受合适的条件，其中当希望所述可表达的多核苷酸表达时，所述配体结合所述适体和/或存在于所述系统或其环境中，来自所述可表达的多核苷酸的mRNA不被降解。34.一种调节基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供系统，所述系统包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：严来兴，罗立明，赵佩雯，
申请(专利权)人：贝勒医学院，
类型：发明
国别省市：美国,US