肽标签及包含它的带有标签的蛋白质制造技术

本发明专利技术以具有下述序列的肽作为肽标签附加于有用蛋白质上而使之表达。Xm(PYn)qPZr。此处，X、Y及Z分别是独立地选自R、G、S、K、T、L、N、Q、H中的氨基酸残基，Y中的至少1个包含K、L、N、Q、H或R。m为0～5的整数，n为1、2或3，q为1～10的整数，r为0～10的整数。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肽标签及包含它的带有标签的蛋白质
本专利技术涉及肽标签及包含它的带有标签的蛋白质、编码该蛋白质的DNA、以及包含该DNA的转化体。
技术介绍
随着基因重组技术的发展，目前通常进行基于异种表达的有用蛋白质的生产。在基于异种表达的有用蛋白质的生产中，作为提高蛋白质的表达、蓄积量的对策，研究了启动子及终止子的选择、翻译增强子、导入基因的密码子改变、蛋白质的细胞内运输及局域化等。例如，专利文献1中公开了在植物等中表达细菌毒素蛋白质的技术，公开了用以一定间隔配置有脯氨酸的肽接头连结细菌毒素蛋白质来实施表达(专利文献1)。另外，除此以外还开发了多个通过使肽标签连结于目标蛋白上而提高其表达的技术(专利文献2、非专利文献1～4)。这些肽标签连结技术大部分是提高目标蛋白的溶解性、抑制细胞内的包涵体的形成、促进目标蛋白的正常表达的技术，并非是以提高蛋白质的表达量为目的的技术。另外，其多数适用于主要使用了大肠杆菌的表达系统。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利5360727号说明书专利文献2：日本专利5273438号说明书非专利文献非专利文献1：Smith，D.B.andJohnson，K.S.，：Gene，67，31，1988非专利文献2：Marblestone，J.g.etal.：ProteinSci.，15，182，2006非专利文献3：diguan，C.etal.：Gene，67，21，1988非专利文献4：Maria.C.V.etal.：Gene，74，365-373，1988
技术实现思路
专利技术所要解决的问题通过使用专利文献1中公开的将脯氨酸以一定间隔配置的肽接头来连结毒素蛋白质，能够实现毒素融合蛋白质在植物内的高蓄积化。然而，该肽接头虽然作为连结多个蛋白质的接头的有用性高，然而作为以单一的目标蛋白的高表达为目的的肽标签的能力没有得到充分地研究，存在有研究的余地。因而，本专利技术的课题在于，提供一种肽标签，在宿主细胞中表达目标蛋白的情况下，可以通过使之与该目标蛋白结合而增加目标蛋白的表达量。用于解决问题的方法本专利技术人等为了实现专利文献1中公开的连接肽的作为蛋白质高表达用肽标签的性能提高，首先着眼于该肽(PG12及PG17)中的脯氨酸的存在，预测通过将存在于脯氨酸(P)与脯氨酸(P)之间的丝氨酸(S)和甘氨酸(G)利用物理化学性质与它们不同的氨基酸置换，或许能进一步提高这些肽所具有的有益的性质。具体而言，准备将肽中的丝氨酸(S)、甘氨酸(G)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)等碱性氨基酸、或天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)等酸性氨基酸、以及丙氨酸(A)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)等立体性或极性不同的在侧链中不具有电荷的氨基酸的肽标签，使它们与目标蛋白融合，由此尝试了目标蛋白的表达提高。其结果是发现，通过在PG12、PG17中将存在于P与P之间的S和G置换为K、L、N、Q或R，将所得的肽附加到目标蛋白上，会提高目标蛋白的表达量。本专利技术是基于此种见解而完成的。即，本专利技术如下所示。[1]一种肽，其具有下述的序列。Xm(PYn)qPZr此处，X、Y及Z分别是独立地选自精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、赖氨酸(K)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)中的氨基酸残基，Y中的至少1个包含K、L、N、Q、H或R。m为0～5的整数，n为1、2或3(n优选为2或3)，q为1～10的整数，r为0～10的整数。[2]根据[1]中记载的肽，其中，G和S的含有率小于60％。[3]根据[1]或[2]中记载的肽，其长度为6～50个氨基酸。[4]根据[1]～[3]任一项中记载的肽，其具有序列号25、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、64、66、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、140、142、143、145、147、149、151、153、155、或157的氨基酸列。[5]一种带有标签的蛋白质，其包含[1]～[4]任一项中记载的肽和有用蛋白质。[6]根据[5]中记载的带有标签的蛋白质，其中，有用蛋白质为人生长激素、干扰素β、木聚糖酶、酯酶、或绿色荧光蛋白(GFP)。[7]根据[5]或[6]中记载的带有标签的蛋白质，其中，所述肽与所述有用蛋白质经由蛋白酶识别序列被连结。[8]根据[5]～[7]任一项中记载的带有标签的蛋白质，其包含分泌信号。[9]一种DNA，其编码[5]～[8]任一项中记载的带有标签的蛋白质。[10]一种重组载体，其包含[9]中记载的DNA。[11]一种转化体，其由[9]中记载的DNA或[10]中记载的重组载体进行了转化。[12]根据[11]中记载的转化体，其中，转化体为酵母、大肠杆菌、短小芽胞杆菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞(包括人培养细胞然而不包括人个体)。[13]一种带有标签的蛋白质的制造方法，其特征在于，培养[11]或[12]中记载的转化体而使带有标签的蛋白质蓄积，回收带有标签的蛋白质。专利技术效果通过使用本专利技术的肽标签，可以提高目标蛋白的表达量。因而，对于使用了酵母、大肠杆菌、短小芽胞杆菌等细胞的蛋白质的生产有用。特别是，大肠杆菌、短小芽胞杆菌在此前对于表达量的标签的效果并不明确，因此在它们中可以实现经由标签的表达提高在产业上非常有用。本专利技术的肽标签是氨基酸为10～30个左右的小的肽，对附加有该肽标签的目标蛋白的结构、功能造成影响的可能性低。因而，可以省略表达后的切割处理的可能性高，在需要肽标签的除去的情况下也可以插入蛋白酶识别序列。附图说明图1是表示导入酵母菌属酵母中的基因构建(hGH或IFNβ表达用)的步骤的图。图2是表示导入大肠杆菌中的基因构建(hGH或IFNβ表达用)的步骤的图。图3是表示导入短小芽胞杆菌中的基因构建(hGH表达用)的步骤的图。图4是表示各附加有标签的IFNβ在酵母菌属酵母中的表达量的图。表示将无标签IFNβ的表达量设为1时的相对值。图5是表示各附加有标签的hGH在酵母菌属酵母中的表达量的图。表示将无标签hGH的表达量设为1时的相对值。图6是表示各附加有标签的IFNβ在大肠杆菌中的表达量的图。表示将无标签IFNβ的表达量设为1时的相对值。图7是表示各附加有标签的hGH在大肠杆菌中的表达量的图。表示将无标签hGH的表达量设为1时的相对值。图8是表示各附加有标签的hGH在短小芽胞杆菌中的表达量的图。表示将无标签hGH的表达量设为1时的相对值。图9是表示导入短小芽胞杆菌中的基因构建(木聚糖酶表达用)的步骤的图。图10是表示导入短小芽胞杆菌中的基因构建(酯酶表达用)的步骤的图。图11是表示导入毕赤酵母中的基因构建(hGH表达用)的步骤的图。图12是表示各附加有标签的木聚糖酶在短小芽胞杆菌中的表达量的图。表示将无标签木聚糖酶的表达量设为1时的相对值。图13是表示各附加有标签的酯酶在短小芽胞杆菌中的表达量的图。表示将无标签酯酶的表达量设为1时的相对值。图14是表示各附加有标签的hGH在毕赤酵母中的表达量的图。表示将无标签hGH的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肽，其具有下述的序列：Xm(PYn)qPZr此处，X、Y及Z分别是独立地选自精氨酸R、甘氨酸G、丝氨酸S、赖氨酸K、苏氨酸T、亮氨酸L、天冬酰胺N、谷氨酰胺Q、组氨酸H中的氨基酸残基，Y中的至少1个包含K、L、N、Q、H或R；m为0～5的整数，n为1、2或3，q为1～10的整数，r为0～10的整数。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.28 JP 2015-256396;2016.08.03 JP 2016-153261.一种肽，其具有下述的序列：Xm(PYn)qPZr此处，X、Y及Z分别是独立地选自精氨酸R、甘氨酸G、丝氨酸S、赖氨酸K、苏氨酸T、亮氨酸L、天冬酰胺N、谷氨酰胺Q、组氨酸H中的氨基酸残基，Y中的至少1个包含K、L、N、Q、H或R；m为0～5的整数，n为1、2或3，q为1～10的整数，r为0～10的整数。2.根据权利要求1所述的肽，其中，G和S的含有率小于60％。3.根据权利要求1或2所述的肽，其长度为6～50个氨基酸。4.根据权利要求1～3中任一项所述的肽，其具有序列号25、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、64、66、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、1...

【专利技术属性】
技术研发人员：小池和好，泷田英司，金田晃一，
申请(专利权)人：出光兴产株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP