用于特异性转换靶向DNA序列的核酸碱基的单子叶植物的基因组序列的转换方法、及其使用的分子复合体技术

本发明专利技术提供修饰单子叶植物细胞所具有的双链DNA的靶向位点的方法，其包括以下步骤，使(由核酸碱基转变酶和与所选择的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的核酸序列识别模块结合而成的)复合体与该双链DNA接触，在该靶向位点中不切割该双链DNA的至少一个链，将该靶向位点的1个以上的核苷酸缺失或转换为其它1个以上的核苷酸，或者向该靶向位点插入1个以上的核苷酸的步骤，其中，该双链DNA与该复合体的接触通过向该单子叶植物细胞导入的编码该复合体的核酸来进行。进一步，也提供用于在该方法中使用的复合体，其由核酸碱基转变酶和与单子叶植物细胞具有的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的核酸序列识别模块结合而成。

Genomic Sequence Conversion Methods and Molecular Complexes Used in Monocotyledon Plants for Specific Conversion of Nucleic Acid Bases of Targeted DNA Sequences

The present invention provides a method for modifying a targeted site of double-stranded DNA in monocotyledon plant cells, comprising the following steps of contacting a complex (composed of a nucleotide base-converting enzyme and a nucleotide sequence recognition module specifically binding to a target nucleotide sequence in the selected double-stranded DNA) with the double-stranded DNA at the targeted site The step of not cutting at least one strand of the double-stranded DNA at a point, deleting or converting more than one nucleotide of the targeted site to another or inserting more than one nucleotide into the targeted site, where the double-stranded DNA contacts the complex by encoding introduced into the monocotyledon plant cell. The nucleic acid of the complex is carried out. Further, a complex for use in this method is provided, which is composed of a nucleic acid base converting enzyme and a nucleic acid sequence recognition module specifically binding to a target nucleotide sequence in a double-stranded DNA of a monocotyledon cell.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于特异性转换靶向DNA序列的核酸碱基的单子叶植物的基因组序列的转换方法、及其使用的分子复合体
本专利技术涉及基因组序列的修饰方法，及其使用的核酸碱基转变酶和核酸序列识别模块的复合体，其不伴随DNA的双链切割(无切割或者单链切割)，而能够进行单子叶植物基因组的特定区域内的核酸碱基的修饰。
技术介绍
单子叶植物是指在被子植物中的一组具有1枚子叶的植物，水稻、小麦、玉米这三大谷物分类于该组。因此，虽然以前对单子叶植物的分子育种进行了热烈的研究，但由于单子叶植物不是农杆菌的宿主，因此作为植物的转化法无法长期利用最一般的农杆菌法，而使用了直接导入法。到了1990年代中旬，从报告了通过使细胞分裂旺盛的细胞感染农杆菌，由此可有效地使水稻转化以来，基于基因导入进行的单子叶植物的分子育种有了大幅进步。另一方面，近年来，作为在各种生物种类中修饰目标的基因、基因组区域的技术，基因组编辑受到了关注。目前，作为基因组编辑的方法，提出了利用由具有非序列依赖性的DNA切割能力的分子、与具有序列识别能力的分子组合而成的人工核酸酶的方法(非专利文献1)。例如，使用由锌指DNA结合结构域与非特异性DNA切割结构域连接而成的锌指核酸酶(ZFN)，来进行在宿主的植物细胞或昆虫细胞中的DNA中的、在目标基因座(genelocus)位置的重组的方法(专利文献1)，使用由DNA核酸内切酶和转录激活子样(TAL)效应子(其为植物病原菌黄单胞菌属所具有的DNA结合模块)连接而成的TALEN，在特定的核苷酸序列内或与其相邻的位点中切割、修饰靶基因的方法(专利文献2)，或者，已报告了利用CRISPR-Cas9系统的方法，CRISPR-Cas9系统由(在真细菌、古细菌所具有的获得性免疫系统中起作用的)DNA序列CRISPR(ClusteredRegularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)和与CRISPR一起具有重要作用的核酸酶Cas(CRISPR-associated)蛋白家族所组合而成(专利文献3)等。另外,最近报告了Cpf1作为CRISPR-Cas系统的新的核酸内切酶(非专利文献2)。进一步，也有报告了使用由核酸酶和PPR蛋白质所连接而成的人工核酸酶，其中，所述PPR蛋白质被构成为利用PPR基序(PPR基序可识别包括35个氨基酸的1个核酸碱基)的连续来识别特定的核苷酸序列的方式，从而在该特定序列的附近切割靶基因的方法(专利文献4)。但是，这些基因组编辑技术基本上以基于核酸酶的DNA双链切割(double-strandedDNAbreaks:DSB)为前提，但存在这样的课题：由于DSB伴随了意想不到的基因组修饰，因此存在强细胞毒性、染色体的重排等副作用，细胞存活数极其少，根据细胞种类不同，本来就难以进行基因修饰。对于上述课题，本专利技术人报告了：使用了催化脱氨基反应的脱氨酶，通过将其与具有DNA序列识别能力的分子连接而成的复合体导入宿主细胞，成功地在包括酵母、大肠杆菌的各种生物种类中，不伴随DSB，而在包含特定的DNA序列的区域中进行了基于核酸碱基转变的基因组序列的修饰(专利文献5)。但是，在如单子叶植物这样的高等植物中使用该方法的情况下，为了进一步提高导入突变效率，期望将待导入的分子复合体的构成、导入后的植物细胞的培养条件等进行进一步优化。另外，在酵母、原核生物中，如从脱氨酶的使用所预测的那样，突变方式主要为碱基取代，而插入/缺失突变的频率较低，因此，需要开发可有效地导入不同方式的突变的技术。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第4968498号公报专利文献2：日本特表2013-513389号公报专利文献3：日本特表2010-519929号公报专利文献4：日本特开2013-128413号公报专利文献5：国际公开第2015/133554号非专利文献非专利文献1：KelvinMEsvelt,HarrisHWang(2013)Genome-scaleengineeringforsystemsandsyntheticbiology,MolecularSystemsBiology9:641非专利文献2：BerndZetscheetal.(2015)Cpf1IsaSingleRNA-GuidedEndonucleaseofaClass2CRISPR-CasSystem,Cell163:759-771
技术实现思路
专利技术要解决的问题因此，本专利技术的第1目的在于提供新型基因组编辑的方法、以及用于此目的的核酸碱基转变酶和经进一步优化的核酸序列识别模块的复合体，其不伴随DSB，即，通过不切割双链DNA或者单链切割，可有效地修饰单子叶植物的基因组基因的特定序列的核酸碱基。另外，本专利技术的第2目的在于提供：可在使用脱氨酶而不伴随DSB的基因组编辑中，以与碱基取代不同的方式有效地向宿主细胞导入突变的办法。解决问题的方法本专利技术人为了完成上述第1目的，首先将作为人工核酸酶的CRISPR/Cas9系统针对水稻进行最优化而成的靶向载体pZH_OsU6gRNA_MMCas9(PlantMolBiol(2015)88:561-572)与脱氨酶进行了组合(参考图1B)。即，向上述靶向载体中的针对水稻的密码子使用而最优化的Cas9编码序列(OsCas9)，导入使目标DNA双链或者一条链的切割能力失活的突变，并且使该编码序列与针对植物的密码子使用而最优化的胞苷脱氨酶编码序列(AtPmCDA)进行融合。进一步，由于植物细胞比酵母等的细胞尺寸大，所以在细胞质中合成的Cas9/脱氨酶融合蛋白的向核的转移效率可能降低的假说下，不仅在Cas9的上游、在脱氨酶的两末端也分别加上了核定位信号(NLS)。将该改良型载体导入水稻愈伤组织，结果可以将靶核苷酸序列内的目标碱基顺利取代为其它碱基。进一步，惊讶地发现，在使用目标DNA的一个链的切割能力失活的(具有切口酶活性)Cas9(D10A)的情况下，主要发生在由脱氨酶而脱氨基的碱基为中心的区域中的缺失突变。另外，本专利技术人在导入突变株的选择步骤中，以比通常使用的培养温度比更低温的温度来培养基因导入后的水稻愈伤组织，结果成功地将导入突变效率进一步提高。本专利技术人基于这些见解进一步反复研究，结果完成了本专利技术。即，本专利技术如下所述。[1]修饰单子叶植物细胞所具有的双链DNA的靶向位点的方法，其包括：使由核酸碱基转变酶、和与所选择的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的核酸序列识别模块结合而成的复合体，与该双链DNA接触，在该靶向位点中不切割的该双链DNA的至少一个链，而使该靶向位点的1个以上的核苷酸缺失或转换为其它1个以上的核苷酸，或者向该靶向位点插入1个以上的核苷酸的步骤，其中，该双链DNA与该复合体的接触通过向该单子叶植物细胞导入编码该复合体的核酸，培养该单子叶植物细胞而使该复合体在细胞内表达来进行。[2]上述[1]所述的方法，其中，上述培养步骤中的至少一部分在与该单子叶植物细胞的最适培养温度比更低温的温度下进行。[3]上述[1]或[2]所述的方法，其中，上述核酸序列识别模块选自：Cas的至少1个DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统、锌指基序、TAL效应子及PPR基序。[4]上述[1]或[2]所述的方法，其中，上述核酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.修饰单子叶植物细胞所具有的双链DNA的靶向位点的方法，其包括以下步骤，使由核酸碱基转变酶和与所选择的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的核酸序列识别模块结合而成的复合体与该双链DNA接触，在该靶向位点中不切割该双链DNA的至少一个链，将该靶向位点的1个以上的核苷酸缺失或转换为其它1个以上的核苷酸，或者向该靶向位点插入1个以上的核苷酸的步骤，其中，该双链DNA与该复合体的接触通过向该单子叶植物细胞导入编码该复合体的核酸，培养该单子叶植物细胞并使该复合体在细胞内表达来进行。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.27 JP 2015-232379;2016.07.06 JP 2016-134611.修饰单子叶植物细胞所具有的双链DNA的靶向位点的方法，其包括以下步骤，使由核酸碱基转变酶和与所选择的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的核酸序列识别模块结合而成的复合体与该双链DNA接触，在该靶向位点中不切割该双链DNA的至少一个链，将该靶向位点的1个以上的核苷酸缺失或转换为其它1个以上的核苷酸，或者向该靶向位点插入1个以上的核苷酸的步骤，其中，该双链DNA与该复合体的接触通过向该单子叶植物细胞导入编码该复合体的核酸，培养该单子叶植物细胞并使该复合体在细胞内表达来进行。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养步骤的至少一部分在与该单子叶植物细胞的最适培养温度比更低温的温度下进行。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸序列识别模块选自：Cas的至少1个DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统、锌指基序、TAL效应子及PPR基序。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸序列识别模块为Cas的至少1个DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述核酸序列识别模块为与指导RNA形成互补链的链的相反链的切割能力失活的CRISPR-Cas系统。6.根据权利要求5所述的方法，其使靶向位点的1个以上的核苷酸缺失。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述核酸碱基转变...

【专利技术属性】
技术研发人员：西田敬二，岛古善平，近藤昭彦，
申请(专利权)人：国立大学法人神户大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP