一种异香豆素类衍生物及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种异香豆素类衍生物及其制备方法和用途，特点是该异香豆素类衍生物的结构式如Ⅰ所示，其制备方法步骤包括通过保藏号为CCTCC No:M2014086的海洋真菌发酵培养获取含有异香豆素类衍生物的发酵物，然后加入甲醇浸泡超声过滤，蒸干，再用乙酸乙酯萃取后蒸干，得粗浸膏，将该提取物经减压硅胶柱层析、反相中压柱层析，最后反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该异香豆素类衍生物具有抗氧化作用，优点是化合物I具有清除自由基能力，可能用于延迟阿尔茨海默病的发病并且有助于缓解其症状。

An coumarin derivative and preparation method and use thereof

The invention discloses an isocoumarin derivative and its preparation method and use, characterized by the structural formula of the isocoumarin derivative as shown in I. The preparation method comprises the steps of obtaining a fermentation product containing isocoumarin derivatives by fermentation culture of marine fungi with the preservation number CCTCC No: M2014086, and then adding a methyl alcohol. The crude extract was obtained by vacuum silica gel column chromatography, reversed-phase medium pressure column chromatography, and finally was purified by reversed-phase semi-preparative high performance liquid chromatography. The isocoumarin derivatives had antioxidant activity and the advantage was that compound I had scavenging freedom. Basic ability may be used to delay the onset of Alzheimer's disease and help alleviate symptoms.

【技术实现步骤摘要】
一种异香豆素类衍生物及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种异香豆素类衍生物，尤其是涉及一种异香豆素类衍生物及其制备方法和用途。
技术介绍
异香豆素类衍生物具有抗癌、抗菌、蛋白酶抑制和抗氧化等生理和生物活性。本专利技术人对海绵共附生真菌Aspergillusustus（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNo:M2014086）固体发酵的乙酸乙酯提取物进行了抗氧化实验，发现其有抗氧化活性，遂对其活性成分进行了研究，分离得到了一种新的异香豆素类衍生物。目前尚未见该化合物的化学结构及其抗氧化活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有抗氧化活性的异香豆素类衍生物及其制备方法和用途。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种异香豆素类衍生物，该异香豆素类衍生物的结构式如Ⅰ所示：（I）。上述异香豆素类衍生物的制备方法，具体包括如下步骤：（1）发酵生产：将保藏号为CCTCCNo:M2014086的焦曲霉（Aspergillusustus）划线复活，然后挑一个单菌落接种到PDB液体培养基中，在28℃、150rpm条件下，培养5天后作为种子液；再将种子液按体积比5-20%的比例接种到大米培养基中，于28℃，静置发酵30天；（2）粗浸膏的获得：往发酵后的锥形瓶中加入甲醇，将固体浸没，超声15分钟，静置过夜后，将甲醇提取液用纱布过滤去除固体残渣；将固体残渣重复浸提3-5次后，将甲醇提取液合并后蒸干除去甲醇，然后用水溶解，再加入与水溶液等体积的乙酸乙酯重复萃取5次，合并萃取液后减压浓缩除去乙酸乙酯，获得粗浸膏；（3）化合物的分离纯化：将粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，采用体积比为2:1的石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，对粗浸膏进行减压硅胶柱层析，收集洗脱组分；采用二氯甲烷和甲醇混合溶剂为洗脱剂，对洗脱组分进行凝胶柱层析（LH-20），收集洗脱组分；将洗脱组分再经过反相中压柱色谱分离，采用甲醇和水为洗脱剂，梯度是从体积分数30%甲醇线性洗脱到100%甲醇，洗脱时间为120分钟，流速为20mL/min，收集出峰时间为80-90分钟的流分，最后该流分经半制备反相高效液相色谱分离纯化得到异香豆素类衍生物，其结构如式I所示：（I）。所述的PDB液体培养基的配方如下：马铃薯200g、葡萄糖20g，海水晶35g以及蒸馏水1L；所述的大米培养基的配方如下：大米100g、海水晶3.5g以及蒸馏水100mL。所述的二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷与甲醇的体积比为1：1。所述的半制备反相高效液相色谱的洗脱液为乙腈与水按体积比28:72混合而成。上述异香豆素类衍生物的应用，所述的异香豆素类衍生物在制备抗氧化剂方面的用途。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术一种异香豆素类衍生物及其制备方法和用途，通过微生物发酵培养来获取含氯芳香类化合物的发酵物，然后将发酵物用甲醇浸泡、乙酸乙酯提取，得粗浸膏，将该粗浸膏经减压硅胶柱层析，凝胶柱层析，中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到，该异香豆素类衍生物可以作为具有抗氧化作用的新药成分或先导化合物；本专利技术通过微生物发酵得到异香豆素类衍生物，操作工艺简单，生产周期短、产品成本低的特点且对环境无污染。上述焦曲霉（Aspergillusustus），该菌为DJ003菌株，保藏编号为CCTCCNo.M2014086，于2014年03月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。附图说明图1为化合物Ⅰ以浓度依赖性方式清除DPPH自由基。化合物Ⅰ或维生素C（VitC）以指定浓度加入到0.2mMDPPH溶液中20分钟，通过评价517nm处的吸光度来测量DPPH自由基的含量，数据表示三次单独实验的平均值±SEM；相对于对照组**p<0.01（ANOVA和Duncet试验）。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1一种异香豆素类衍生物结构式如Ⅰ所示：（I）。实施例2如I式所示的异香豆素类衍生物的制备方法，步骤如下：（1）发酵生产：将保藏号为CCTCCNo:M2014086的焦曲霉（Aspergillusustus）划线复活，然后挑一个单菌落接种到PDB液体培养基中，在28℃、150rpm条件下，培养5天后作为种子液；再将种子液按体积比5-20%的比例接种到大米培养基中，于28℃，静置发酵30天；其中PDB液体培养基的配方如下：马铃薯200g、葡萄糖20g，海水晶35g以及蒸馏水1L；所述的大米培养基的配方如下：大米100g、海水晶3.5g以及蒸馏水100mL；（2）粗浸膏的获得：往发酵后的锥形瓶中加入甲醇，将固体浸没，超声15分钟，静置过夜后，将甲醇提取液用纱布过滤去除固体残渣；将固体残渣重复浸提3-5次后，将甲醇提取液合并后蒸干除去甲醇，然后用水溶解，再加入与水溶液等体积的乙酸乙酯重复萃取5次，合并萃取液后减压浓缩除去乙酸乙酯，获得粗浸膏；（3）化合物的分离纯化：将粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，采用体积比为2:1的石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，对粗浸膏进行减压硅胶柱层析，收集洗脱组分；采用二氯甲烷和甲醇混合溶剂为洗脱剂，对洗脱组分进行凝胶柱层析（LH-20），收集洗脱组分；将洗脱组分再经过反相中压柱色谱分离，采用甲醇和水为洗脱剂，梯度是从体积分数30%甲醇线性洗脱到100%甲醇，洗脱时间为120分钟，流速为20mL/min，收集出峰时间为80-90分钟的流分，最后该流分经半制备反相高效液相色谱分离纯化得到异香豆素类衍生物，其结构如式I所示：（I）。其中二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷与甲醇的体积比为1：1；半制备反相高效液相色谱的洗脱液为乙腈与水按体积比28:72混合而成。该化合物Ⅰ紫红色粉末，分子式C14H18O5，[α]=-23.83(c0.2,CHCl3)，阳离子HRESIMSm/z：284.1490[M+NH4]+，1H和13C-NMR数据见表1。表1化合物Ⅰ的1H和13CNMR数据(600和150MHz，inDMSO-d6)a注：本表信号归属基于DEPT、1H-1HCOSY、HSQC及HMBC图谱解析结果。氢信号多重度分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和m(多重峰)表。实施例3体外抗氧化活性的测试（清除自由基活性测试）（1）实验样品被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施例2中分离纯化的化合物Ⅰ纯品，精密称取适量样品，供测活性。（2）实验方法通过DPPH自由基清除测定确定化合物Ⅰ的抗氧化性质。将各种浓度的药物加入到DPPH的甲醇溶液（0.2mM）中。将混合物（200μL/孔）加入96孔板中，并在室温下摇动20分钟。用酶标仪在517nm处测量吸光度。用维生素C作为阳性对照。使用下式计算DPPH自由基清除活性：DPPH自由基清除活性（％）=[（对照的吸光度-样品的吸光度）/对照的吸光度]×100。（3）实验结果在化合物Ⅰ清除自由基的测试中。化合物Ⅰ或维生素C（VitC）以指定浓度加入到0.2mMDPPH溶液中20分钟，通过评价517nm处的吸光度来测量DPPH自由基的含量。如图1所示，化合物Ⅰ浓度依赖性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种异香豆素类衍生物，其特征在于该异香豆素类衍生物的结构式如Ⅰ所示：

【技术特征摘要】
1.一种异香豆素类衍生物，其特征在于该异香豆素类衍生物的结构式如Ⅰ所示：（I）。2.一种根据权利要求1所述的异香豆素类衍生物的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：（1）发酵生产：将保藏号为CCTCCNo:M2014086的焦曲霉（Aspergillusustus）划线复活，然后挑一个单菌落接种到PDB液体培养基中，在28℃、150rpm条件下，培养5天后作为种子液；再将种子液按体积比5-20%的比例接种到大米培养基中，于28℃，静置发酵30天；（2）粗浸膏的获得：往发酵后的锥形瓶中加入甲醇，将固体浸没，超声15分钟，静置过夜后，将甲醇提取液用纱布过滤去除固体残渣；将固体残渣重复浸提3-5次后，将甲醇提取液合并后蒸干除去甲醇，然后用水溶解，再加入与水溶液等体积的乙酸乙酯重复萃取5次，合并萃取液后减压浓缩除去乙酸乙酯，获得粗浸膏；（3）化合物的分离纯化：将粗浸膏用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，采用体积比为2:1的石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，对粗浸膏进行减压硅胶柱层析，收集洗脱组分；采用二氯甲烷和甲醇混合溶剂为洗脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁立建，何山，黄立明，崔巍，斯拉瓦·爱泼斯坦，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33