一种烟草中NNN旋光异构体分离及测定的合相色谱串联质谱方法技术

本发明专利技术涉及一种烟草中N‑亚硝基降烟碱（NNN）旋光异构体分离及测定的合相色谱串联质谱方法，属于烟草化学分析领域。本发明专利技术采用含0.5%醋酸的甲醇溶液对烟草样品中的(S)‑NNN和(R)‑NNN进行提取，提取液过滤后，使用UPC2‑MS/MS对提取液中(S)‑NNN和(R)‑NNN的浓度进行分析和定量。该方法的样品前处理过程简单、快速，便于批量样品的分析。且在以合相色谱串联质谱进行检测时，所用到的主要流动相为超临界流体CO2，助溶剂使用极少量的甲醇，具有环境友好的优点。本检测方法对(S)‑NNN的检出限为0.21ng/mL，定量限为0.69ng/mL，对(R)‑NNN的检出限为0.34ng/mL，定量限为1.12ng/mL。该方法灵敏度高，重复性好，适用于烟草样品中N‑亚硝基降烟碱旋光异构体的分离及测定。

A method for the separation and determination of NNN optical isomers in tobacco by liquid chromatography tandem mass spectrometry

The invention relates to a phase chromatography tandem mass spectrometry method for the separation and determination of N_nitroso-nicotine (NNN) rotatory isomers in tobacco, belonging to the field of tobacco chemical analysis. The methanol solution containing 0.5% acetic acid is used to extract (S) NNN and (R) NNN from tobacco samples. After filtering the extract, the concentrations of (S) NNN and (R) NNN in the extract are analyzed and quantified by UPC2_MS/MS. The sample pretreatment process of the method is simple and fast, and is convenient for the analysis of batch samples. The main mobile phase used in LC-MS is supercritical fluid CO2, and the cosolvent uses very small amount of methanol, which is environmentally friendly. The detection limit of (S) NNN was 0.21 ng/mL, the quantitative limit was 0.69 ng/mL, the detection limit of (R) NN was 0.34 ng/mL and the quantitative limit was 1.12 ng/mL. The method has high sensitivity and good reproducibility, and is suitable for the separation and determination of N_nitroso-nicotine rotatory isomers in tobacco samples.

【技术实现步骤摘要】
一种烟草中NNN旋光异构体分离及测定的合相色谱串联质谱方法
本专利技术涉及一种烟草中N-亚硝基降烟碱（NNN）旋光异构体分离及测定的合相色谱串联质谱方法，属于烟草化学分析领域。
技术介绍
N-亚硝基降烟碱（NNN）是在烟草调制和加工过程中，烟草生物碱降烟碱的亚硝化作用而产生的，具有强烈致癌性，被认为是吸烟人群中食管癌和口腔癌的重要诱因。在其分子结构中，四氢吡咯环上的2位碳原子具有手性，因此NNN具有两个对映异构体，即(S)-NNN和(R)-NNN。毒理学研究证明(S)-NNN的致癌性强于(R)-NNN。因此，对于烟草中NNN对映异构体的分离和测定可为吸烟与健康相关的研究提供潜在参考，也可为降低卷烟危害性研究提供潜在的新思路。目前关于NNN对映异构体分离的文献报道较少，仅HechtS.S.课题组报道过两种分析方法。一种基于气相色谱-热能分析联用技术，该方法采用了Cyclosil-B手性柱，分析时间较长，在约35min时(S)-NNN和(R)-NNN才分离完全。另一种是基于液相色谱-串联质谱技术，该方法采用PirkleCovalent(S,S)-Whelk-O1Kromasil为手性固定相，在约22min内实现了(S)-NNN和(R)-NNN的分离。而关于(S)-NNN和(R)-NNN分离的合相色谱或合相色谱串联质谱法未见报道。合相色谱串联质谱其实质是基于超临界流体色谱的一种色谱技术，近年来，随着超临界流体色谱仪器上重大改善，使得其有了更广泛的应用空间，也引起了越来越多科研工作者的关注。鉴于合相色谱同样采用无毒、不易燃且不污染环境的超临界流体CO2作为主要流动相，是一种真正的绿色环保技术，相比于液相色谱和气相色谱有很多突出优势，对于结构类似物、异构体、对映体和非对映异构体具有很好的分离度和选择性，且结合串联质谱检测器的使用，使得检测的灵敏度进一步提高。本专利技术旨在根据烟草样品的特点，通过合相色谱串联质谱法对烟草样品中的N-亚硝基降烟碱（NNN）旋光异构体(S)-NNN和(R)-NNN进行分离分析和定量检测，方法快速且灵敏度高，将为(S)-NNN和(R)-NNN的测定提供潜在的高通量检测技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种烟草样品中(S)-NNN和(R)-NNN测定的合相色谱串联质谱（UPC2-MSMS）快速分析方法，采用酸化甲醇溶液对烟草样品中的NNN进行提取，提取液经有机相滤膜过滤后，使用UPC2-MSMS对提取液中的(S)-NNN和(R)-NNN进行分离和定量检测。本方法的样品前处理简单、环保且分析时间短，适用于烟草中(S)-NNN和(R)-NNN的检测。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：烟草中(S)-NNN和(R)-NNN的测定方法，包括以下步骤：（1）称取0.25~0.5g烟末样品，加入5~10mL含0.5%（v/v）醋酸的甲醇溶液，超声提取后过滤，得到待测溶液；（2）取待测溶液进行超高效合相色谱串联质谱（UPC2-MS/MS）分析，分析条件如下：色谱条件：采用CHIRALPAK®IG-3色谱柱，规格100mm×3.0mm,3.0μm，柱温：35℃；进样量：1μL；流动相A：CO2，流动相B：甲醇；流速：1.5mL/min；背压：2000psi；补偿溶剂：含0.1%（v/v）甲酸的甲醇溶液，流速：0.3mL/min；洗脱梯度如表1所示。质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子模式，源温度：150°C；毛细管电压：4.5kV；去溶剂气温度：350℃；去溶剂气流速：800L/h；反吹气流速：50L/h；多反应监测模式（MRM），详细参数见表2。。（3）采用外标标准曲线法定量计算样品中(S)-NNN和(R)-NNN的含量。步骤（1）中超声提取的功率为100W，频率为40KHz，提取时间30~60min。步骤（1）中过滤采用0.22μm的有机相滤膜。步骤（3）中外标标准曲线法为：配制含(S)-NNN和(R)-NNN目标物的系列标准工作溶液，以目标物的色谱峰面积对其浓度进行回归分析，得到标准曲线；将步骤（2）的分析结果代入标准曲线中，得到待测溶液中目标物的浓度；再计算得到样品中(S)-NNN和(R)-NNN的含量。本专利技术的有益效果本专利技术首次建立了烟草中N-亚硝基降烟碱（NNN）旋光异构体(S)-NNN和(R)-NNN分离和测定的合相色谱串联质谱方法。主要是根据烟草样品的特点，对影响色谱分离效果的色谱柱的选择进行了优化。该方法的样品前处理过程简单、快速，便于批量样品的分析。且在以合相色谱串联质谱进行检测时，所用到的主要流动相为超临界流体CO2，助溶剂使用极少量的甲醇，具有环境友好的优点。本检测方法对(S)-NNN的检出限为0.21ng/mL，定量限为0.69ng/mL，对(R)-NNN的检出限为0.34ng/mL，定量限为1.12ng/mL。该方法灵敏度高，重复性好，适用于烟草样品中N-亚硝基降烟碱旋光异构体的分离及测定。附图说明图1为选用不同色谱柱分离效果对比图。图2为样品提取液总离子流图。具体实施方式本专利技术结合实例做进一步描述，但并不限制本专利技术。实例1：（1）仪器与试剂：合相色谱串联质谱仪（美国Waters公司）；超声仪（KQ-700DB型，昆山市超声仪器有限公司）。外消旋NNN和(R)-NNN标准品（加拿大TorontoResearchChemicals）；甲醇（韩国DUKSAN，色谱纯）；醋酸（≥99.7%，FisherScientific）。（2）仪器工作条件：仪器的色谱条件和质谱条件如前面所述，这里不再重复。其中，色谱条件里色谱柱的选择主要考察了CHIRALPAK®AD-3色谱柱和CHIRALPAK®IG-3色谱柱。不同色谱柱上(S)-NNN和(R)-NNN的分离结果如图1所示。可见，鉴于合相色谱的优异的分离效率，(S)-NNN和(R)-NNN在两种色谱柱上均分裂为两个色谱峰，这是由NNN中的-N=O的E和Z立体异构产生的(E)-NNN和(Z)-NNN。因此外消旋NNN标准品在手性柱上分裂为4个色谱峰。以往文献报道以LC-MSMS方法检测NNN时，由于E和Z立体异构的存在而出现肩峰现象，而UPC2-MS/MS获得的近乎达到基线分离的结果在以往研究中均未见报道。另外，需要注意的是，通过对(R)-NNN标准品的分析可知，在CHIRALPAK®AD-3色谱柱上，色谱峰1和3对应的是(S)-NNN的E和Z立体异构体，2和4对应的是(R)-NNN的E和Z立体异构体。而在CHIRALPAK®IG-3色谱柱上，色谱峰1和2对应的是(S)-NNN的E和Z立体异构体，3和4对应的是(R)-NNN的E和Z立体异构体。鉴于我们需要关注(S)-NNN和(R)-NNN的组成，而不需要关注每个旋光异构体中E和Z立体异构的组成，且考虑到便于仪器自动积分和定量，最终确定使用CHIRALPAK®IG-3色谱柱。（3）样品前处理：称取0.5g（精确至0.0001g）烟末样品于50mL的具塞三角瓶中，准确加入10mL含0.5%醋酸甲醇溶液，将三角瓶盖上后100W超声提取60min。用0.22μm水相滤膜对提取液进行过滤得到待测溶液，采用UPC2-MSMS进行测定。（4）标准工作溶液配制：标准工作溶液的配制主要包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草中N‑亚硝基降烟碱（NNN）旋光异构体分离及测定的合相色谱串联质谱方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）称取0.25~0.5g烟末样品，加入5~10mL含0.5%醋酸的甲醇溶液，超声提取后过滤，得到待测溶液；（2）取待测溶液进行超高效合相色谱串联质谱（UPC2‑MS/MS）分析，分析条件如下：色谱条件：采用CHIRALPAK® IG‑3色谱柱，规格100mm × 3.0mm, 3.0μm，柱温：35℃；进样量：1μL；流动相A：CO2，流动相B：甲醇；流速：1.5mL/min；背压：2000psi；补偿溶剂：含0.1%甲酸的甲醇溶液；流速：0.3mL/min；洗脱梯度如表1所示：

【技术特征摘要】
1.一种烟草中N-亚硝基降烟碱（NNN）旋光异构体分离及测定的合相色谱串联质谱方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）称取0.25~0.5g烟末样品，加入5~10mL含0.5%醋酸的甲醇溶液，超声提取后过滤，得到待测溶液；（2）取待测溶液进行超高效合相色谱串联质谱（UPC2-MS/MS）分析，分析条件如下：色谱条件：采用CHIRALPAK®IG-3色谱柱，规格100mm×3.0mm,3.0μm，柱温：35℃；进样量：1μL；流动相A：CO2，流动相B：甲醇；流速：1.5mL/min；背压：2000psi；补偿溶剂：含0.1%甲酸的甲醇溶液；流速：0.3mL/min；洗脱梯度如表1所示：质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子模式，源温度：150°C；毛细管电压：4.5kV；去溶剂气温度：350℃；去溶剂气流速：800L/h；反吹气流速：50L/h；多反应监测模式（MRM），详细参数见表2：（3）采用外标标准曲线法定量计算样品中(S)-NNN和(R)-NNN...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓惠敏，范子彦，刘珊珊，杨飞，李中皓，闫丽萍，王颖，卢鹏，金静静，边照阳，唐纲岭，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：河南,41