A method of regulating some or all copies of genes in a cell is provided, which includes introducing one or more such RNA sequences into the cell, the RNA sequences comprising all or part of the complementary parts of each target nucleic acid sequence in one or more target nucleic acid sequences, and the nucleic acid sequences encoding Cas proteins, and The cell is maintained in such a condition in which the Cas protein is expressed, and the Cas protein binds to and regulates one or more target nucleic acid sequences in the cell.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多重基因组编辑相关申请数据本申请要求于2015年10月8日提交的美国临时申请号62/239,239号的优先权,其通过引用纳入本文用于所有目的。
技术介绍
经由序列特异性核酸酶的基因组编辑是已知的。基因组中核酸酶介导的双链DNA(dsDNA)断裂可以通过两种主要机制修复:非同源性末端连接(NHEJ)或同源定相修复(HDR),所述NHEJ常常导致导入非特异性的插入和缺失(插入缺失),所述HDR纳入同源性链作为修复模板。参见参考文献4,通过引用其全文纳入本文。当序列特异性核酸酶与包含所需突变的同源供体DNA构建体一起递送时,基因靶向效率相较于仅仅只有供体构建体的情况增强了1000倍。已经研发了替代性方法来使基因组修饰的过程加速,该方法通过直接将位点特异性核酸酶的DNA或mRNA注入一个细胞胚胎以在不同物种的特定基因座生成DNA双链断裂(DSB)。然后,通过这些位点特异性核酸酶诱导的DSB可以通过易错非同源性末端连接(NHEJ)被修复,获得在切割位点携带缺失或插入的突变小鼠和大鼠。如果用与侧接DSB的末端具有同源性的供体质粒共同注入,那么高保真同源性重组可以产生具有靶向整合的动物。因为这些方法需要针对各靶基因对锌指核酸酶(ZNF)或转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)进行复杂设计,并且因为靶向的效率可能会显著变化,所以至今尚未报道多重基因靶向。因此,需要用于生产遗传修饰的细胞以生成动物(如猪)的改进方法,以用作器官移植潜在的器官来源。
技术实现思路
本文描述了成簇且规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白(CRISPR/Cas)系统的应用, ...
【技术保护点】
1.一种使细胞中一个或多个靶核酸序列的表达失活的方法,其包括:向细胞导入一个或多个核糖核酸(RNA)序列和编码Cas蛋白的核酸序列,所述RNA序列包含与所述一个或多个靶核酸序列中各靶核酸序列的全部或部分互补的部分;并且将所述细胞维持在这样的条件下,其中,Cas蛋白在所述条件下表达,并且所述Cas蛋白结合所述细胞中的一个或多个靶核酸序列并使所述一个或多个靶核酸序列失活。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.08 US 62/239,2391.一种使细胞中一个或多个靶核酸序列的表达失活的方法,其包括:向细胞导入一个或多个核糖核酸(RNA)序列和编码Cas蛋白的核酸序列,所述RNA序列包含与所述一个或多个靶核酸序列中各靶核酸序列的全部或部分互补的部分;并且将所述细胞维持在这样的条件下,其中,Cas蛋白在所述条件下表达,并且所述Cas蛋白结合所述细胞中的一个或多个靶核酸序列并使所述一个或多个靶核酸序列失活。2.如权利要求1所述的方法,其中,所述导入步骤包括用所述一个或多个RNA序列以及所述编码Cas蛋白的核酸序列转染所述细胞。3.如权利要求1所述的方法,其中,将所述一个或多个RNA序列、所述编码Cas蛋白的核酸序列、或其组合导入所述细胞的基因组中。4.如权利要求1所述的方法,其中,所述Cas蛋白的表达是诱导型的。5.如权利要求1所述的方法,其中,所述细胞来自胚胎。6.如权利要求1所述的方法,其中,所述细胞是干细胞、受精卵、或生殖细胞。7.如权利要求6所述的方法,其中,所述干细胞是胚胎干细胞或多能干细胞。8.如权利要求1所述的方法,其中,所述细胞是体细胞。9.如权利要求8所述的方法,其中,所述体细胞是真核细胞。10.如权利要求9所述的方法,其中,所述真核细胞是动物细胞。11.如权利要求10所述的方法,其中,所述动物细胞是猪细胞。12.如权利要求1所述的方法,其中,所述一个或多个靶核酸序列包括猪内源性逆转录病毒(PERV)基因。13.如权利要求12所述的方法,其中,所述PERV基因包括pol基因。14.如权利要求13所述的方法,其中,所述pol基因的一个或多个拷贝被灭活。15.如权利要求14所述的方法,其中,所述细胞中的所述pol基因的全部拷贝被灭活。16.如权利要求1所述的方法,其中,所述Cas蛋白是Cas9。17.如权利要求1所述的方法,其中,所述一个或多个RNA序列是约10-约1000个核苷酸。18.如权利要求1所述的方法,其中,所述一个或多个RNA序列是约15-约200个核苷酸。19.一种调节细胞中一个或多个靶核酸序列的方法,其包括:向所述细胞导入核酸序列,所述核酸序列编码与所述细胞中靶核酸序列的全部或部分互补的RNA;向所述细胞导入编码酶的核酸序列,所述酶与所述RNA相互作用并且以位点特异性方式切割所述靶核酸序列;并且将所述细胞维持在这样的条件下,在所述条件下RNA结合互补靶核酸序列,形成复合物,并且其中,所述酶结合所述复合物上的结合位点,并且调节所述一个或多个靶核酸序列。20.如权利要求19所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员:G·M·丘奇,杨璐菡,M·格尔,
申请(专利权)人:哈佛学院董事及会员团体,
类型:发明
国别省市:美国,US
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