本发明专利技术公开了一种短管赤眼蜂DNA酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，将短管赤眼蜂DNA酶的编码基因整合到酵母基因组DNA的表达系统中，并进行高密度发酵和乙醇诱导表达得到短管赤眼蜂DNA酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。本发明专利技术的短管赤眼蜂DNA酶具有较强的DNA降解活性，成功应用于去除PCR或qRT‑PCR反应体系中残留的痕量DNA污染，提高致病菌核酸检测试剂盒的准确性。
A short tube Trichogramma DNA enzyme and its preparation method and Application
The present invention discloses a coding gene of DNA enzyme of Trichogramma brevis, whose nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:1 or SEQ ID NO:2, integrates the coding gene of DNA enzyme of Trichogramma brevis into the expression system of yeast genomic DNA, and obtains the DNA enzyme of Trichogramma brevis by high-density fermentation and ethanol induction. Columns are shown as SEQ ID NO:3 or SEQ ID NO:4. The DNA enzyme of Trichogramma brevis has strong DNA degrading activity, and is successfully applied to remove trace DNA contamination in PCR or qRT_PCR reaction system, and improves the accuracy of pathogenic bacteria nucleic acid detection kit.
【技术实现步骤摘要】
一种短管赤眼蜂DNA酶及其制备方法与应用
本专利技术属于生物工程
，具体是一种短管赤眼蜂DNA酶及其制备方法与应用。
技术介绍
DNA酶广泛存在于多种哺乳动物、虾类、昆虫和植物中，对于个体的发育、细胞正常的老化凋亡、以及防御系统的构建具有重要的生物学功能。DNA酶是一种多功能核酸内切酶,可以以非特异性的方式切割DNA,作用于两个脱氧核糖核苷酸之间的3',5'-磷酸二酯键，将DNA链切割开并将其降解成单个核苷酸或寡聚核苷酸。其中研究最多的是哺乳动物和人类的DNA酶，例如来源于牛胰腺的DNaseI被广泛应用于生物学研究和医学分子检测试剂盒，而来源于人的重组DNaseI还被应用于一些疾病的治疗，例如囊肿性纤维化(cysticfibrosis,CF)、肺不张和复杂性肺炎伴胸腔积液和脓胸等。在科学研究和分子临床诊断中，DNA酶是一个功能强大的工具,可用于一系列的分子生物学应用,包括:反转录PCR(RT-PCR，包括荧光定量法和传统的凝胶成像法)去除模板中DNA污染造成的假阳性，组织和细胞RNA提取后基因组DNA污染的去除，核酸法检测病毒和致病菌时模板中DNA污染的去除，以及基因表达调控中DNA顺式作用原件的蛋白质特异性结合鉴定等等。近些年来的研究发现，DNA酶也是昆虫防御系统的重要组成部分，例如对黄蜂毒液的主要成分进行分析，发现包括组胺、五羟色胺、蛋白酶、缓激肽、DNA酶和透明质酸酶等。相对于人和哺乳动物的DNA酶，昆虫的DNA酶相关的研究相对较少，对它们的活性研究以及应用实例也处在相对缺乏的状态。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种短管赤眼蜂DNA酶及其制备方法与应用。本专利技术采用的技术方案如下：通过高通量的DNA和蛋白序列的比对以及活性中心保守序列的分析，发现了一个来源于短管赤眼蜂的全新DNA酶，该酶由一个以前功能未知的基因编码(Trichogrammapretiosumuncharacterized,Genbankaccessionnumber:LOC111693613)。本专利技术提供的一种短管赤眼蜂DNA酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示。本专利技术还提供一种编码短管赤眼蜂DNA酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供一种重组载体，在质粒pPic9K上插入了含有上述短管赤眼蜂DNA酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供一种重组细胞，将上述重组载体转化入宿主细胞中获得，优选毕赤氏酵母GS115。本专利技术还提供短管赤眼蜂DNA酶的制备方法，短管赤眼蜂DNA酶是一个以前从未被阐明的未知基因(Genbankaccessionnumber:LOC111693613)所编码。虽然该基因在DNA和蛋白序列上与已知的牛和人的DNaseI、北极甜虾的双链特异性DNA酶等同源性较低，但是在活性中心的保守催化氨基酸残基以及空间结构与这些已知的DNA酶高度相似。首先经过信号肽序列分析，确定了具有DNA酶活性的成熟蛋白的序列，并且根据毕赤氏酵母表达系统进行密码子优化以后，将短管赤眼蜂DNA酶基因克隆到酵母表达载体中，并通过电击转化方法得到多拷贝整合到酵母基因组DNA中的表达系统，并进行高密度发酵和乙醇诱导表达得到短管赤眼蜂DNA酶，体外DNA降解实验表明，短管赤眼蜂DNA酶能有效降解双链DNA，其活性与来源于牛胰腺的DNaseI相当，短管赤眼蜂DNA酶具有较强的脱氧核糖核酸酶活性，并且其活性高度依赖于二价镁离子(Mg2+)，加入高于镁离子浓度的螯合剂EDTA后可有效抑制其酶活。本专利技术的短管赤眼蜂DNA酶经过纯化后，具有较强的DNA降解活性，成功应用于去除PCR或qRT-PCR反应体系中残留的痕量DNA污染，提高致病菌核酸检测试剂盒的准确性。本专利技术的有益效果是：本专利技术的短管赤眼蜂DNA酶具有较强的DNA降解活性，成功应用于去除PCR、RNA提取和反转录或qRT-PCR反应体系中残留的痕量DNA污染，提高致病菌核酸检测试剂盒的准确性。此外，微生物发酵方法生产蛋白质或抗体过程中，从全细胞裂解液中提取蛋白时，加入该DNA酶能有效降低粘度，有效去除基因组DNA杂质，提高纯度，降低提纯工艺的难度。附图说明图1为本专利技术短管赤眼蜂DNA酶活性中心及附近序列与其它一些已知的DNA酶的序列比对；图2为本专利技术短管赤眼蜂DNA酶的蛋白序列N端信号肽分析；图3为本专利技术正确携带短管赤眼蜂的DNA酶基因的pPic9K质粒图谱；图4为用毕赤氏酵母分泌表达的短管赤眼蜂DNA酶的发酵上清液对质粒DNA的降解活性检测；图5为用毕赤氏酵母分泌表达的短管赤眼蜂DNA酶经过纯化后，应用于致病菌核酸检测试剂盒的模板污染物的去除结果检测；图6为毕赤氏酵母分泌表达的短管赤眼蜂DNA酶经过纯化后的SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色结果示意图。具体实施方式为了加深对本专利技术的理解，下面将结合实施例和附图对本专利技术作进一步详述，该实施例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术保护范围的限定。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本专利技术所涉及到的术语除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本专利技术的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。术语“DNA酶”意指可以特异性或非特异性方式将线性或者环状的脱氧核糖核酸的3',5'-磷酸二酯键，将DNA链切割开并将其降解成单个核苷酸或二聚、三聚或者寡聚核苷酸的具有催化活性的蛋白质。术语“信号肽”意指一个短的肽(通常16-30氨基酸长)，位于新合成的分泌蛋白质的N-端，这些蛋白质包括那些最终定位于胞外或者某些细胞器之内(内质网，高尔基体或体)的从细胞内分泌的蛋白。信号肽在将目的蛋白转运到细胞器或者胞外后，将被特异性的酶切除，从而获得成熟的蛋白质。术语“PCR”意指聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR。聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方。聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。术语“引物”意指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，除非特定限制，否则所述术语涵盖自然中生物的DNA复制和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物(通常为DNA引物)。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。除非特定限制，否则上游引物为在DNA复制时，作为DNA模板3’端的复制起始点的引物，下游引物为在DNA复制时，作为DNA模板5’端的复制起始点的引物。术语“缓冲液”意指一类当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种短管赤眼蜂DNA酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
【技术特征摘要】
1.一种短管赤眼蜂DNA酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示。2.根据权利要求1所述的一种短管赤眼蜂DNA酶，其特征在于，所述短管赤眼蜂DNA酶的活性高度依赖于二价镁离子，加入高于镁离子浓度的螯合剂EDTA后可有效抑制其酶活。3.一种重组载体，其特征在于，在质粒pPic9K上插入了含有权利要求2所述的短管赤眼蜂DNA酶的编码基因。4.一种重组细胞，其特征在于，将权利要求3所述的重组载体转化入宿主细胞中获得。5.一种权利要求1所述的短...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨波，冯子璇，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。