用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡与制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测犬C‑反应蛋白的免疫荧光层析检测卡与制备方法；旨在提供一种灵敏度高，检测结果可靠的用于检测犬C‑反应蛋白的免疫荧光层析检测卡；其技术要点包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，所述结合垫上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY，所述的硝酸纤维膜设有一条包被鸡IgY的质控C线，以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线；属于动物疫病检测领域。

Immunofluorescence chromatography card and preparation method for detecting canine C- reactive protein

The invention discloses an immunofluorescence chromatography detection card for detecting canine C-reactive protein and a preparation method thereof; aims at providing an immunofluorescence chromatography detection card with high sensitivity and reliable detection results for detecting canine C-reactive protein; the technical points include a substrate, which is connected with a sample pad and a binding pad in turn. The binding pad is provided with fluorescent microsphere-labeled CRP monoclonal antibody and fluorescent microsphere-labeled sheep anti-chicken IgY. The nitric acid fiber membrane is provided with a quality control C line coated with chicken IgY and a detection T line coated with CRP monoclonal antibody, belonging to the field of animal epidemic disease detection.

【技术实现步骤摘要】
用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡与制备方法
本专利技术公开了一种免疫荧光层析检测卡，具体地说，是一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，本专利技术还公开了该免疫荧光层析检测卡的制备方法。
技术介绍
C反应蛋白(CRP)是机体非免疫系统的组成成分，在多种哺乳动物疾病的急性期有重要的诊断警示作用。CRP在肝脏的合成反应主要由IL-1、IL-6和TNF-α等炎症因子所调节。CRP浓度受年龄、性别和体重的影响不大。在人类临床医学诊断中，CRP作为炎性或非炎性疾病的诊断标志物进行检测已超过30年。在兽医临床上，犬CRP的检测在临床应用中也比较广泛，包括急性感染性疾病的诊断和鉴别诊断、手术后感染的监测、抗生素疗效的观察、病程监测及预后判断等。犬CRP对疾病敏感度高，能在疾病早期快速升髙，及时反映病情；而且CRP的浓度不受到抗生素及免疫抑制剂的影响，在治疗中可以准确地对疾病的发展进行监测，在临床诊疗中具有很高的价值。因此作为炎症标记物，CRP在兽医临床上的作用日趋显著，检测犬CRP对临床诊断、疗效及预后观察等具有重要价值。CRP是由肝脏合成的一种能与肺炎链球菌C多糖反应形成复合物的急性时相反应蛋白。它由5个相同的亚基单位以非共价方式联接，与人CRP不同，犬CRP的5个亚基中有两个被糖基化。研究表明，各种抗其他物种CRP蛋白的抗血清，都不能和急性期犬血清或者分离的犬CRP发生交叉反应，说明其他物种CRP和犬CRP没有共同的抗原性，这种现象也说明犬CRP的快速检测方法不能依赖于人的商品化CRP快速检测试纸条。目前，临床中快速检测犬CRP的方法多是依赖于临床检测仪器，这在普通宠物医院并不具备。而且，对于动物疫病诊断行业，很多情况下，对于疾病的诊断需要在野外进行，这对于现行犬CRP检测方法是没有办法完成的。时间分辨荧光免疫层析技术采用稀土元素(如Eu3+等)克服了荧光微球灵敏度较差的缺点。与放射性免疫分析相比，时间分辨荧光免疫层析技术无放射性污染，具有灵敏度高、抗基质干扰性好，稳定性强等优点。中国专利ZL201710468614.6公开了一种犬C反应蛋白胶体金免疫层析试纸条，由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫、底板依次组成，所述结合物释放垫上包被有鼠抗犬C反应蛋白单克隆抗体-胶体金标记物，所述反应膜上包括检测区和质控区，所述检测区包被有鸡抗犬C反应蛋白多克隆抗体，所述质控区包被有羊抗鼠抗抗体。该方法选用了胶体金作为示踪物，免疫标记物依靠静电吸附，存在灵敏度较低、难以定量、重复性和稳定性较差等缺陷，无法完全满足临床的检测需求。中国专利ZL201710468621.6公开了一种犬C反应蛋白荧光检测试纸条，由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫、底板依次组成，所述结合物释放垫上包被有鼠抗犬C反应蛋白单克隆抗体-荧光微球标记物，所述反应膜上包括检测区和质控区，所述检测区包被有鸡抗犬C反应蛋白多克隆抗体，所述质控区包被有羊抗鼠抗抗体；但是该方法存在下述缺点:检测线包被抗体为多克隆抗体，可能会影响到检测的特异性；另外反应膜检测区和质控区发生免疫反应时，共用一种标记物：鼠抗犬C反应蛋白单克隆抗体-荧光微球标记物，当样本中C反应蛋白变化是，C线荧光值将相应变化，从而可能影响C值和T/C值的稳定性，从而严重影响定量的准确性。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种灵敏度高，检测结果重现性的用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡。本专利技术的第二个目的是提供上述检测试剂卡的制备方法。为此，本申请提供的第一个技术方案是这样的:一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，包括底板，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫,所述结合垫上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY，所述的硝酸纤维膜设有一条包被鸡IgY的质控C线，以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线。进一步的，上述的用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，还包括样品稀释液瓶。进一步的，上述的用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，所述的样品稀释液瓶中含的样品稀释液为含1％S9和0.1％TritonX-100的的0.1M的pH7.8Tris-盐酸缓冲液。本专利技术的第二个技术方案是提供上述检测试剂卡的制备方法。一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法，在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫，A)所述的样品垫的制备方法为：1)配制样品垫处理液：含1％牛血清白蛋白、2％聚乙二醇4000和0.5％TritonX-100的pH9.00.1M的甘氨酸缓冲液；2)将步骤1)中制备的缓冲液5.0μl/cm的浓度喷涂于玻璃纤维上；B)所述的结合垫的制备方法为：1)将用荧光微球标记CRP单克隆抗体和用荧光微球标记的羊抗鸡IgY按照体积比20:1混合均匀，超声2s，间歇5s，重复3次；2)按3.5μl/cm、0.02MPa喷至剪裁后的结合垫上；C)所述的反应膜的制备方法为：1)用含3％蔗糖的pH7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到1mg/mL，即为C质控线工作液；2)用含3％蔗糖的pH7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将CRP单克隆抗体稀释到1mg/mL，即为T检测线工作液；3)取底板粘贴硝酸纤维膜；4)在硝酸纤维膜上划T线和C线，划线浓度均为1μL/cm；5)完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜。进一步的，上述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法，荧光微球标记CRP单克隆抗体的制备方法为：1)稀释荧光微球：取一离心管，加入1mL标记缓冲液0.1MMES缓冲液，加入荧光微球1mg，涡旋混匀；2)微球的活化：在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B，旋转培养器上反应30min；3)活化淬灭：将活化后的荧光微球20000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入5000μl淬灭剂，超声2s；4)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入20-200μgCRP单克隆抗体，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；5)封闭：加入2mL标记封闭液，超声2s，间歇5s，重复3次，超声完成后置于旋转培养器上反应30min；6)纯化：完成上述反应后，19000g离心30min，吸去上清，留取沉淀，加入2mL标记荧光微球稀释液，超声，工作2S，间歇5S，重复3次。进一步的，上述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法，荧光微球标记的羊抗鸡IgY的制备方法为：1)稀释微球：取一离心管，加入1mL的标记缓冲液标记缓冲液0.1MMES缓冲液，取荧光微球1.0mg，涡旋混匀；2)微球的活化：在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B，旋转培养器上反应30min；3)活化淬灭：将活化后的荧光微球19000g离心30min，弃上清，留取沉淀，加入2mL淬灭剂，90W超声，工作2s，间歇5s，重复1次；4)抗体的标记：在超声重悬后的荧光微球中加入1000μg羊抗鸡IgY，涡旋混匀，置于旋转培养器上反应30min；5)封闭：加入500μl标记封闭液，封闭30min；6)纯化：完成上述反应后，19000本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测犬C‑反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，包括底板(1)，在底板(1)上依次衔接有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维膜(4)和吸水垫(5),其特征在于，所述结合垫(3)上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体(31)和荧光微球标记的羊抗鸡IgY(32)，所述的硝酸纤维膜(4)设有一条包被鸡IgY的质控C线，以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，包括底板(1)，在底板(1)上依次衔接有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维膜(4)和吸水垫(5),其特征在于，所述结合垫(3)上设有荧光微球标记的CRP单克隆抗体(31)和荧光微球标记的羊抗鸡IgY(32)，所述的硝酸纤维膜(4)设有一条包被鸡IgY的质控C线，以及一条包被CRP单克隆抗体的检测T线。2.根据权利要求1所述的用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，其特征在于，还包括样品稀释液瓶(6)。3.根据权利要求2所述的用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡，其特征在于，所述的样品稀释液瓶(6)中含的样品稀释液含1％S9和0.1％TritonX-100的的0.1M的pH7.8Tris-盐酸缓冲液。4.制备权利要求1所述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的方法，在底板(1)上依次衔接有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维膜(4)和吸水垫(5)，其特征在于，A)所述的样品垫的制备方法为：1)配制样品垫处理液：含1％牛血清白蛋白、2％聚乙二醇4000和0.5％TritonX-100的pH9.00.1M的甘氨酸缓冲液；2)将步骤1)中制备的缓冲液5.0μl/cm的浓度喷涂于玻璃纤维上；B)所述的结合垫(3)的制备方法为：1)将用荧光微球标记CRP单克隆抗体和用荧光微球标记的羊抗鸡IgY按照体积比20:1混合均匀，超声2s，间歇5s，重复3次；2)按3.5μl/cm、0.02MPa喷至剪裁后的结合垫上；C)所述的反应膜的制备方法为：1)用含3％蔗糖的pH7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到1mg/mL，即为C质控线工作液；2)用含3％蔗糖的pH7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液将CRP单克隆抗体稀释到1mg/mL，即为T检测线工作液；3)取底板(1)粘贴硝酸纤维膜；4)在硝酸纤维膜上划T线和C线，划线浓度均为1μL/cm；5)完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜。5.根据权利要求4所述的一种用于检测犬C-反应蛋白的免疫荧光层析检测卡的制备方法，其特征在于，荧光微球标记CRP单克隆抗体的制备方法为：1)稀释荧光微球：取一离心管，加入1mL标记缓冲液0.1MMES缓冲液，加入荧光微球1mg，涡旋混匀；2)微球的活化：在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B，旋转培养器上反应30min；3)活化淬灭：将活化后的荧光微球20000...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤永平，梁展鹏，
申请(专利权)人：广州敏捷生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44