用于检测非洲猪瘟病毒CD2v蛋白抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v蛋白抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，旨在提供一种用于非洲猪瘟病毒抗体的大量筛查以及将来用于CD2v基因缺失株疫苗免疫猪群中鉴别非洲猪瘟野毒株的感染的检测非洲猪瘟病毒CD2v蛋白抗体的双抗原夹心法免疫荧光层析检测试剂；其技术方案包括盒体，所述的盒体内设有CD2v蛋白抗体免疫荧光层析检测卡和装有血清稀释液的血清稀释液瓶，装有标准阳性血清的标准阳性血清瓶，装有标准阴性血清的标准阴性血清瓶；所述的CD2v蛋白抗体免疫荧光层析检测卡包括PVC底板，所述的PVC底板上从左至右依次设有吸收垫、反应膜、结合垫和样品垫，所述的结合垫上负载有荧光标记的CD2v蛋白和荧光标记的羊抗鸡IgY，所述的反应膜设有一条检测线T，一条质控线C，所述的检测线T上包被有重组CD2v蛋白，所述的质控C线上包被有羊抗鸡IgY免疫球蛋白。

【技术实现步骤摘要】
用于检测非洲猪瘟病毒CD2v蛋白抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v蛋白抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)感染家猪和野猪引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，临床以猪高热、食欲废绝、皮肤发绀、内脏实质器官出血、呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物疫病，在我国被列为一类动物疫病。该病病程极短、死亡率高。非洲猪瘟病毒基因型众多，目前已知有24个基因型。迄今为止，该病尚无商品化的疫苗，疫情的防控主要依靠加强饲养场生物安全管理、限制生猪和猪产品跨区域流动、对疫点和疫区内所有生猪采取扑杀等措施。1921年，Montgomery首次报道在肯尼亚发生非洲猪瘟疫情。2007年以来，非洲猪瘟在中东欧多个国家扩散并流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，2018年8月，我国辽宁省沈阳市沈北区首次发现非洲猪瘟疫情，经核酸检测和序列比对分析发现，该毒株与俄罗斯和中东欧国家流行的格鲁吉亚毒株(Georgia2007)属于同一进化支，属于基因II型毒株。随后，在我国的河南、江苏、内蒙古、黑龙江、浙江、安徽、等多个省份(自治区、直辖市)呈现散发流行，对我国养猪业造成了数十亿元的经济损失。由于ASF可给养猪业造成毁灭性打击，因此，ASF疫苗研究从未间断。迄今，国际上采用基因工程手段获得了多个ASFV基因缺失疫苗候选株，以及通过细胞传代致弱和从自然界分离弱毒株的方法获得了弱毒疫苗候选株，基因缺失株疫苗研究较多的是MGF和CD2v基因缺失株。国外2017年构建了CD2v缺失的BA71株(基因I型)已经充分致弱，免疫猪后存活率均100％[Monteagudo，P.L.，etal.，BA71DeltaCD2：ANewRecombinantLiveAttenuatedAfricanSwineFeverViruswithCross-ProtectiveCapabilities.JVirol，2017.91(21).]。2019年国内构建了CD2v和MGF双基因缺失株，能使免疫猪获得100％的保护[张艳艳，等，非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株的构建和免疫保护特性，中国兽医学报，2019.39(8),1421-1427]。2020年国内又构建了更安全有效的非洲猪瘟病毒7基因缺失疫苗株[WeiyeC.，etal.，Aseven-gene-deletedAfricanswinefevervirusissafeandeffectiveasaliveattenuatedvaccineinpigs.SciChinaLifeSci,2020.63(3)]，在这些疫苗候选株中CD2v基因均为必缺基因，又因其为病毒的外膜蛋白并具有良好的免疫原性，使其成为建立鉴别诊断疫苗株与野毒株血清学诊断方法的首选靶抗原。我国的国情决定了现阶段应走疫苗免疫防控路线，随着疫苗的使用，鉴别疫苗株与野毒株的显得尤为重要，因此研制相关的快速诊断试剂盒十分迫切。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种用于非洲猪瘟病毒抗体的大量筛查，以及将来用于CD2v基因缺失株疫苗免疫猪群中鉴别非洲猪瘟野毒株的感染的试剂盒。一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，包括盒体，所述的盒体内设有CD2v抗体免疫荧光层析检测卡和装有血清稀释液的血清稀释液瓶，装有标准阳性血清的血清瓶D，装有标准有阴性血清的血清瓶E；所述的CD2v抗体免疫荧光层析检测卡包括PVC底板，所述的PVC底板上从左至右依次设有吸收垫、反应膜、结合垫和样品垫，所述的结合垫上负载有荧光标记的CD2v蛋白和荧光标记的羊抗鸡IgY，所述的反应膜设有一条检测线T，一条质控线C，所述的检测线T上包被有重组CD2v蛋白，所述的质控C线上包被有羊抗鸡IgY免疫球蛋白。进一步的，上述的一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，所述的CD2v抗体免疫荧光层析检测卡位于卡壳内，所述的卡壳位于盒体内，所述的卡壳上设有加样孔，所述的加样孔与样品垫相对应。进一步的，上述的一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，所述的盒体内设有ID芯片卡、盒体外设有ID芯片卡相适配的二维码。进一步的，上述的一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，所述的反应膜通过下述方法制得的：用含3％蔗糖的PB分别稀释CD2v蛋白和羊抗鸡IgY免疫球蛋白至浓度为1mg/ml，得检测线溶液和质控线溶液，在反应膜上划线，在膜的一端用记号笔做好质控线和检测线的标记，质控线和检测线的距离为5mm，检测T线与硝酸纤维素膜下缘的距离为10mm，划线浓度均为1μL/cm，完成后将片材放置在温度18～26℃、湿度≤30％的干燥室中干燥16～18h，干燥完迅速装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口，2～8℃保存，待用。进一步的，上述的一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，所述的结合垫的通过下述步骤制得的：1)将1mg纳米稀土荧光微球超声分散，用活化缓冲液MES稀释10倍，加入到2ml的EP管中；加入10mg的活化剂EDC和10mg的活化剂NHS混匀，活化15min-30min；14000r/min，离心15min；倒掉上清液，加入1ml偶联缓冲液，然后用超声波分散均匀，边搅拌边滴加CD2v蛋白或羊抗鸡IgY100μg，室温混匀1小时，加入封闭剂封闭1小时，14000r/min，离心15min，去上清，加入复溶液分散均匀，即标记好的T线标记物或C线标记物；2)将8964玻纤裁为10mm*300mm大小，将标记好的T线标记物和C线标记物，按照体积比1:10比例混合，按3μl/cm、0.02MPa采用喷金划膜仪喷至剪裁后的8964上，放置在18～26℃、湿度≤30％的干燥室中干燥16～18h，干燥完迅速装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口，2～8℃保存，待用。进一步的，上述的一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，所述的样品垫通过下述步骤制得的：配制含1％S9、0.5％曲拉通、0.05％叠氮钠的Tris样品垫工作液；按40ml/张RB65玻纤投料，每张用滚轮铺均匀，37℃干燥24h，用切刀裁为23mm*300mm大小，装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口待用。进一步的，上述的一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，所述的血清稀释液为含0.8wt％S21、0.03wt％Proclin300的0.01M的pH7.4磷酸盐缓冲液。进一步的，上述的一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，所述的标准阳性血清通过下述步骤制得的：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，包括盒体(A)，其特征在于，所述的盒体(A)内设有CD2v抗体免疫荧光层析检测卡(B)和装有血清稀释液的血清稀释液瓶(C)，装有标准阳性血清的血清瓶(D)，装有标准有阴性血清的标准血清瓶(E)；所述的CD2v抗体免疫荧光层析检测卡(B)包括PVC底板(1)，所述的PVC底板(1)上从左至右依次设有吸收垫(2)、反应膜(3)、结合垫(4)和样品垫(5)，所述的结合垫(4)上负载有荧光标记的CD2v蛋白和荧光标记的羊抗鸡IgY，所述的反应膜(3)设有一条检测线T，一条质控线C，所述的检测线T上包被有重组CD2v蛋白，所述的质控C线上包被有羊抗鸡IgY免疫球蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，包括盒体(A)，其特征在于，所述的盒体(A)内设有CD2v抗体免疫荧光层析检测卡(B)和装有血清稀释液的血清稀释液瓶(C)，装有标准阳性血清的血清瓶(D)，装有标准有阴性血清的标准血清瓶(E)；所述的CD2v抗体免疫荧光层析检测卡(B)包括PVC底板(1)，所述的PVC底板(1)上从左至右依次设有吸收垫(2)、反应膜(3)、结合垫(4)和样品垫(5)，所述的结合垫(4)上负载有荧光标记的CD2v蛋白和荧光标记的羊抗鸡IgY，所述的反应膜(3)设有一条检测线T，一条质控线C，所述的检测线T上包被有重组CD2v蛋白，所述的质控C线上包被有羊抗鸡IgY免疫球蛋白。


2.根据权利要求1所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，其特征在于，所述的CD2v抗体免疫荧光层析检测卡(B)位于卡壳(6)内，所述的卡壳(6)位于盒体(A)内，所述的卡壳(6)上设有加样孔(7)，所述的加样孔(7)与样品垫(5)相对应。


3.根据权利要求1所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，其特征在于，所述的盒体(A)内设有ID芯片卡(8)，盒体(A)外设有ID芯片卡(8)相适配的二维码(9)。


4.根据权利要求1所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，其特征在于，所述的反应膜通过下述方法制得的：
用含3％蔗糖的PB分别稀释CD2v蛋白和羊抗鸡IgY免疫球蛋白至浓度为1mg/ml，得检测线溶液和质控线溶液，在反应膜上划线，在膜的一端用记号笔做好质控线和检测线的标记，质控线和检测线的距离为5mm，检测T线与硝酸纤维素膜下缘的距离为10mm，划线浓度均为1μL/cm，完成后将片材放置在温度18～26℃、湿度≤30％的干燥室中干燥16～18h，干燥完迅速装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口，2～8℃保存，待用。


5.根据权利要求1所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，其特征在于，所述的结合垫的通过下述步骤制得的：
1)将1mg纳米稀土荧光微球超声分散，用活化缓冲液MES稀释10倍，加入到2ml的EP管中；加入10mg的活化剂EDC和10mg的活化剂NHS混匀，活化15min-30min；14000r/min，离心15min；倒掉上清液，加入1ml偶联缓冲液，然后用超声波分散均匀，边搅拌边滴加CD2v蛋白或羊抗鸡IgY100μg，室温混匀1小时，加入封闭剂封闭1小时，14000r/min，离心15min，去上清，加入复溶液分散均匀，即标记好的T线标记物或C线标记物；
2)将玻璃纤维膜裁剪为10mm*300mm大小，将标记好的T线标记物和C线标记物，按照体积比1:10比例混合，按3μl/cm、0.02MPa采用喷金划膜仪喷至剪裁后的玻璃纤维膜上，放置在18～26℃、湿度≤30％的干燥室中干燥16～18h，干燥完迅速装到铝膜袋中，加入干燥剂，封口，2～8℃保存，待用。


6.根据权利要求1所述的一种用于检测非洲猪瘟病毒CD2v蛋白抗体的双抗原夹心免疫荧光层析试剂盒，其特征在于，所述的样品垫通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤永平，蒋智勇，羊晓珊，梁展鹏，刘卫，李闯，
申请(专利权)人：广州敏捷生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44