伏马毒素人工抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种伏马毒素人工抗原及其制备方法与应用，旨在提供一种制备简单、避免使用有机溶液、一步反应可实现、同时小分子与载体蛋白通过稳定的酰胺键连接、提高了抗原免疫原性的伏马毒素人工抗原及其制备方法，其技术方案：1）将载体蛋白采用EDC和NHS活化，制备载体蛋白活化酯溶液；2）将伏马毒素溶于甲醇缓冲溶液中，形成小分子溶液；3）将步骤2）制备的小分子溶液加至载体蛋白活化酯溶液中，室温下搅拌16～24h；4）反应结束后室温透析，去除未反应的小分子物质，即可得到所述的伏马毒素人工抗原；属于免疫化学技术领域。属于免疫化学技术领域。属于免疫化学技术领域。

【技术实现步骤摘要】
伏马毒素人工抗原及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于免疫化学
，更具体地说，涉及伏马毒素人工抗原，本专利技术还是涉及该抗原的制备方法与应用。

技术介绍

[0002]伏马菌素(fumonisin)主要是由串珠镰刀菌属产生的一类有毒害和致癌性的真菌毒素，主要污染玉米、小麦、稻米等粮食作物及其制品，伏马毒素为自然产生，食用含有伏马毒素的食品后可引起人类或动物的脑白质软化症、肺水肿症候群以及人类食道癌等人畜疾病有关。另外，伏马毒素还是一种慢性促癌剂，能引起灵长类动物的动脉粥样硬化样改变。 国际癌症研究中心(IARC）将伏马毒素列为2B 类致癌物质(即人类可能致癌物），并对其在饲料及食品中含量做了限量(1～3 mg/kg)规定。
[0003]国内外已建立了多种伏马毒素的检测方法，已经应用的有高效液相色谱（HPLC）、毛细管气相色谱法（GC）、毛细管电泳技术（CE）、液质联用（LC/MS）、气质联用（GC/ MS）及酶联免疫吸附检测（ELISA）等方法。其中高效液相色谱法（HPLC），灵敏度高，在全球范围内的玉米及其制品的调查中，90% 以上的实验室用的都是HPLC 法，其检测限可以达到 0.05～0.1 mg/kg。但是，该法需要对检测样品进行严格的预处理，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，同时要求有专业的操作人员，不利于在基层推广使用及大量样本筛选。
[0004]免疫学技术具有敏感、特异、简便的特点，近年来已被应用于伏马毒素的残留检测。而胶体金法虽然具备操作简单、检测时间短和无需专业技术人员操作等优点，但其灵敏度相对不足，加大了样本干扰，同时定量也相对较差。因此开发高灵敏、可定量、操作更加简便的检测方法并推广应用，具有十分重要的意义。
[0005] 中国专利CN201210433003.5公开了 检测伏马毒素的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其包括酶标板、伏马毒素标准品、伏马毒素抗体工作液、伏马毒素酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液，该检测方法特异性和灵敏性不够高，操作过程比较繁琐。
[0006]另外，伏马毒素人工抗原目前主要采用戊二醛法跟胺基偶联，但此法不可控，可能发生的副反应很多，可以形两个小分子间反应，两个载体蛋白间反应，可能会出现每次出来的结果不一样，所以此法重复性非常差。而本专利技术提供的合成方案，只有一种反应可能，那就是载体蛋白上面的羧基经活化后，只能单一的伏马毒素上的胺基反应生成稳定的酰胺键结构。

技术实现思路

[0007]针对上述问题，本专利技术的目的第一个目的是提供一种人工抗原操作简单，避免了有机溶液的使用，一步反应可实现，同时全抗原结构中完整地保留了小分子的结构，提高了抗原的免疫原性的伏马毒素人工抗原及其制备方法。
[0008]本专利技术的第二个目的是含上述伏马毒素抗原为免疫原，采用杂交瘤技术进行制备
得到的单克隆抗体。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供将伏马毒素人工抗原的应用。主要是用于时间分辨荧光定量免疫层析技术，可快速、便捷地实现伏马毒素的检测的试纸条以及制备方法。为此，本专利技术提供的第一个技术方案是这样的：一种伏马毒素人工抗原，所述人工抗原的结构如式Ⅰ所示：其中，protein为蛋白质载体，n代表伏马毒素与蛋白质载体的连接数量，可能为10
‑
40之间的任一数字。
[0010]进一步的，上述的伏马毒素人工抗原，所述蛋白质载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。
[0011]本专利技术提供的第二个技术方案是这样的：上述伏马毒素人工抗原的方法，依次包括下述步骤：1）将载体蛋白采用EDC和NHS进行活化，制备载体蛋白活化酯溶液；2）将伏马毒素溶于磷酸缓冲溶液中，形成小分子溶液；3）再将步骤2）制备的小分子溶液加至载体蛋白活化酯溶液中，室温下搅拌16～24h；4）带反应结束后室温透析，去除未反应的小分子物质，即可得到所述的伏马毒素人工抗原；步骤3）所述的载体蛋白和伏马毒素质量比为30
‑
150:30。
[0012]其合成路线如下：
进一步的，上述的伏马毒素人工抗原的制备方法，所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液；所述透析采用的透析液为磷酸缓冲溶液；所述透析采用的透析液为磷酸缓冲溶液，透析时间为3天，每天换3次透析液。
[0013]本专利技术还有一个技术方案是这样的：一种伏马毒素单克隆抗体，以第一个技术方案所述的伏马毒素抗原为免疫原，采用杂交瘤技术进行制备得到的单克隆抗体。
[0014]第一个技术方案所述的伏马毒素人工抗原在制备伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条中的应用。
[0015]本专利技术还有一个技术方案，一种伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条，所述纸条中的反应膜包被有第一个技术方案所述的伏马毒素人工抗原和鼠IgG。
[0016]进一步的，上述的一种伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条，包括PVC板，所述的PVC板中部叠置包被有上述制备的伏马毒素人工抗原和鼠IgG的反应膜，两端分别叠置样品垫和吸水垫，所述的反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，质控区靠近吸水垫。
[0017]上述的伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，依次包括下述步骤：1）制备包被有人工抗原和鼠IgG的反应膜以NC膜为反应膜，将NC膜固定粘贴在PVC背衬的中间部位，将载体蛋白为牛血清白蛋白的伏马毒素人工抗原用包被缓冲液调节浓度至0.1~0.5mg/mL，并将鼠IgG用包被缓冲液也调节浓度至0.5~1mg/mL，按照 0.8~1.2
µ
L/cm的膜液量，将抗原和鼠IgG划线到反应膜对应的检测区和质控区，检测区和质控区之间间隔为5 mm，放置 40~45℃烘箱处理48小时以，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用包被缓冲液为含有0.5% PEG20000、1%蔗糖、0.5% BSA、0.05%叠氮化钠的0.01 M PBS缓冲液；
2）制备样品垫将裁剪好的空白样品垫浸泡在样品本处理液中，浸泡5 min后，取出在37℃干燥24 h以上，置于恒温恒湿保藏箱里备用，所用样品垫处理液为含有0.05% 吐温20、1% 蔗糖、0.5% BSA、0.05%叠氮化钠的0.05M PBS缓冲液；3）时间分辨荧光免疫层析试纸条的组装：在PVC板背衬中部叠置步骤1）制得的反应膜，两端分别叠置步骤2）制得的样品垫和吸水垫，反应膜和吸水垫、样品垫相搭连，检测区靠近样品垫，质控区靠近吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成试纸条，将试纸条装载于试纸卡内，得时间分辨荧光免疫层析试纸条。
[0018]上述的伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条用于定量检测伏马毒素。
[0019]与现有技术相比，本专利技术提供的技术方案具有如下技术优点：1、本专利技术合成的人工抗原操作简单，避免了有机溶液的使用，一步反应可实现，同时全抗原结构中完整地保留了小分子的结构，提高了抗原的免疫原性；2、将伏马毒素人工抗原结合ELISA检测技术，对伏马毒素的IC50值可达88ng/ml；3、将伏马本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种伏马毒素人工抗原，其特征在于，所述人工抗原的结构如式Ⅰ所示：其中，protein为蛋白质载体，n代表伏马毒素与蛋白质载体的连接数量，为10
‑
40之间的任一数字。2.根据权利要求1所述的伏马毒素人工抗原，其特征在于，所述蛋白质载体为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。3.权利要求1所述的伏马毒素人工抗原的制备方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)将载体蛋白采用EDC和NHS进行活化，制备载体蛋白活化酯溶液；2)将伏马毒素溶于缓冲溶液中，形成小分子溶液；3)再将步骤2）制备的小分子溶液加至载体蛋白活化酯溶液中，室温下搅拌16～24h；4）待反应结束后室温透析，去除未反应的小分子物质，即可得到所述的伏马毒素人工抗原；步骤3）所述的载体蛋白和伏马毒素质量比为30
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150:30。4.根据权利要求3所述的伏马毒素人工抗原的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液；所述透析采用的透析液为磷酸缓冲溶液。5.一种伏马毒素单克隆抗体，其特征在于，以权利要求1所述的伏马毒素人工抗原为免疫原，采用杂交瘤技术进行制备得到的单克隆抗体。6.权利要求1所述的伏马毒素人工抗原在制备伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条中的应用。7.一种伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述纸条中的反应膜包被有权利要求1所述的伏马毒素人工抗原和鼠IgG。8.根据权利要求7所述的一种伏马毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于，包括PVC板，所述的PVC板中部叠置包被有权利要求1所述的伏马毒素人工抗原和鼠IgG的反应膜，两端分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤永平，梁展鹏，羊晓珊，
申请(专利权)人：广州敏捷生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：