胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条及试纸卡制造技术

本发明专利技术涉及一种胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条及包含该试纸条的试纸卡，所述试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述结合垫上具有荧光微球标记的胱抑素C单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有由胱抑素C多克隆抗体或单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。本发明专利技术的试纸条实现了对胱抑素C进行快捷、定量检测分析，且试纸条灵敏度高、准确性好、线性范围宽、检测所用时间短、使用方便，能满足床旁急诊和现场快速检测需求。

Cystatin C fluorescent microsphere immunochromatographic assay for quantitative test strip and test paper card

The invention relates to a cystatin C fluorescent microsphere immunochromatographic quantitative detection test strip and a test strip card comprising the test strip. The test strip comprises a base plate, a sample pad, a binding pad, a cellulose nitrate membrane and a water absorbent paper. The binding pad is provided with a cystatin C monoclonal antibody labeled with a fluorescent microsphere, and the nitrocellulose membrane. Coated with a detection line consisting of cystatin C polyclonal antibody or monoclonal antibody and a quality control line consisting of sheep anti-mouse IgG polyclonal antibody. The test strip of the invention realizes the quick and quantitative detection and analysis of cystatin C, and the test strip has the advantages of high sensitivity, good accuracy, wide linear range, short detection time and convenient use, and can meet the requirements of emergency bedside and on-site rapid detection.

【技术实现步骤摘要】
胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条及试纸卡
本专利技术属于免疫检测
，具体涉及一种快速、高灵敏度的胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条、以及包含所述试纸条的试纸卡。
技术介绍
胱抑素C（CystatinC，简称CysC）的基因编码位于人类第20号染色体短臂上，胱抑素C基因含有管家基因，能在所有组织恒定且持续地转录和表达。所有有核细胞均可合成胱抑素C并很快分泌到细胞外，无组织特异性，可分布于肾、肝、胰、肠、胃、肺及胎盘等几乎全身所有组织，在脑脊液和精液中浓度最高，尿液最低。胱抑素C分子量小（13KD），生理条件下带正电荷，能自由从肾小球滤过，完全被肾小管上皮细胞重吸收并于细胞内降解，不重新回到血液中；同时肾小管上皮细胞也不分泌CysC至管腔内。因此，其血清浓度主要由肾小球过滤率（GFR）决定，CysC即成为反映肾小球滤过情况的重要指标。胱抑素C在临床上被视为监测肾功能的一项高灵敏度、高特异性指标血清胱抑素C被认为是较血清肌酐(BUN)、尿素氮等更理想、更灵敏的检测肾小球过滤率内源性指标。此外，作为一种新的评估肾功能的内源性标记物，胱抑素C在评价由糖尿病、急性肾功能衰竭、高血压、类风湿性关节炎等原因引起的早期肾损害方面起着重要的作用。目前临床及实验室检测胱抑素C主要采用抗原、抗体反应为理论基础的免疫学方法。按原理大体上可将检测方法分为二类，一类是非均相法：单向免疫扩散法(RID)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、酶联免疫测定法(ELISA)；一类是均相法：颗粒计数免疫测定法、颗粒增强透射免疫比浊法(PETIA)、颗粒增强散射免疫比浊(PENIT)、溶胶颗粒免疫测定法(SPIAs)等。目前临床多选择胶乳增强免疫比浊法作为常规检测胱抑素C，例如，中国专利申请201410735830.9公开了一种改良的胱抑素C检测试剂盒及其制备方法，然而，该方法需配套使用大型全自动生化分析仪，虽能作高通量检测，但是仪器贵且体型大，检测时间较长，灵敏度低、准确度不高，不适用于床边及时检测，无法用于急诊检测。时间分辨荧光免疫分析法是一种新型的检测手段，利用稀土离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，与其螯合剂、增强液在待反应体系（如：抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等）发生特异性亲和反应后，用时间分辨荧光分析仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，推测反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。相较于其他免疫检测技术，可极大地提高灵敏度，并获得较为宽阔的线性范围，实现现场快速定量检测，成为目前国内外研究的新热点。而针对胱抑素C，利用时间分辨荧光免疫分析法对其进行定量检测的相关技术和检测工具尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够对胱抑素C进行高灵敏度、高准确性、宽线性范围、使用方便的定量检测分析工具，使得能够缩短检测时间，满足床旁和现场急诊检测需求。为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：一种胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条，所述试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述结合区上具有荧光微球标记的胱抑素C单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有由胱抑素C多克隆抗体或单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。优选地，所述荧光微球为羧基荧光微球，所述羧基荧光微球可以是粒径为50nm-500nm、优选180nm-210nm的镧系元素铕（Eu3+）鳌合物。优选地，所述胱抑素C单克隆抗体为鼠源胱抑素C单克隆抗体，可市售获得；所述所述胱抑素C多克隆抗体为兔源、羊源、豚鼠源、鼠源胱抑素C多克隆抗体，可市售获得。优选地，所述样品垫为经处理液浸透处理并干燥的玻璃纤维膜，更优选地，所述处理液的组成成分包括Tris–HCl缓冲液、BSA、吐温20、蔗糖、NaN3，专利技术人通过设计正交实验对各组分浓度、PH进行研究，优选的处理液由以下组成组成：工作浓度为0.01-0.1M、pH为6.0-9.0的Tris–HCl缓冲液，质量浓度为0.01-1%的BSA，质量浓度为0.01%-1%的吐温20、质量浓度为0.1%-5%蔗糖，以及质量浓度为0.01-1%的NaN3；更优选地，所述处理液由以下组分组成：工作浓度为0.01M、pH为7.5-8.0的Tris–HCl缓冲液，质量浓度为0.05-0.5%的BSA，质量浓度为0.1%-0.5%的吐温20、质量浓度为3%蔗糖，以及质量浓度为0.05%的NaN3。通过采用特定组成的处理液对玻璃纤维膜进行处理，可提高样品垫的微球释放率，减少聚集，并且在检测线后方无荧光干扰。在具体实施方式中，所述样品垫和结合垫可以由分离的、不同的两部分构成，例如，由两片部分重叠摆放的经处理的玻璃纤维膜分别构成样品垫和结合垫，其中，采用铺球工艺将荧光微球标记的胱抑素C单克隆抗体直接铺至结合垫上。优选地，所述样品垫和结合垫可以由单一的玻璃纤维膜构成，例如，采用喷球工艺将荧光微球标记的胱抑素C单克隆抗体直接喷涂至一片经处理的玻璃纤维膜的一端，形成结合区，所述玻璃纤维膜的另一端形成加样区。具体而言，所述样品垫在20℃-45℃、优选37℃下干燥0.5-24h、例如2h后，将所述荧光微球标记的胱抑素C单克隆抗体以3-40ul/ml、优选8-10ul/ml的量喷涂至玻璃纤维膜上，在20℃-45℃、优选37℃下干燥0.5-24h，放于干燥环境备用。经上述工艺优化，可直接在单一的玻璃纤维膜上形成结合区，相较于样品垫与结合垫分离的形式，简化了试纸条的结构和制备工艺，并且相较于铺球工艺，减少微球聚集，有利于微球释放，使得检测线（T线）和质控线（C线）以外的荧光干扰更少，试纸条质量更优。具体地，所述荧光微球标记的胱抑素C单克隆抗体由以下方法制备获得：将荧光微球和EDC用活化缓冲液进行一步法活化或者将荧光微球与EDC、NHS用活化缓冲液进行二步法活化，然后在复溶缓冲液中沉淀，加入胱抑素C单克隆抗体进行震荡偶联，离心，在复溶缓冲液中沉淀，加入封闭液封闭，在2-8℃、优选4℃下保存备用。优选地，所述活化缓冲液可选自于Tris-HCl缓冲液、PB缓冲液、硼酸缓冲液，优选工作浓度0.01-0.1M，PH=6.0-9.0；所述复溶缓冲液选自于Tris-HCl缓冲液、PB缓冲液、硼酸缓冲液，优选工作浓度0.01-0.1M，PH6.0-9.0；优选地，所述封闭液优选含1-20%BSA、优选含10%BSA的封闭液。优选地，所述底板为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件，例如PVC板，当样品垫和结合垫由单一的玻璃纤维膜构成时，所述玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸依次设置在所述底板上，所述玻璃纤维膜上的结合区压在硝酸纤维素膜的一端，所述吸水纸压在硝酸纤维素膜的另一端。当样品垫和结合垫由分离的、不同的两片玻璃纤维膜构成时，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次设置在所述底板上，重叠接触。本专利技术还提供了上述胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸的制备方法，所述方法包括如下步骤：（1）将玻璃纤维膜在处理液中浸透处理，在20-45℃、优选30-37℃恒温干燥箱中干燥0.5-24h、优选1-6h，将荧光微球标记的胱抑素C单克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条，所述试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述结合垫上具有荧光微球标记的胱抑素C单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有由胱抑素C多克隆抗体或胱抑素C单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。

【技术特征摘要】
1.一种胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条，所述试纸条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述结合垫上具有荧光微球标记的胱抑素C单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有由胱抑素C多克隆抗体或胱抑素C单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。2.根据权利要求1所述的胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，所述荧光微球为羧基荧光微球，优选地，所述羧基荧光微球是粒径为50nm-500nm、优选180nm-210nm的镧系元素铕（Eu3+）鳌合物。3.根据权利要求1所述的胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，所述样品垫和结合垫均为经处理液浸透处理并干燥的玻璃纤维膜。4.根据权利要求3所述的胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，所述处理液的组成成分包括Tris–HCl缓冲液、BSA、吐温20、蔗糖、NaN3，优选地，所述处理液的组成成分包括：工作浓度为0.01-0.1M、pH为6.0-9.0的Tris–HCl缓冲液，质量浓度为0.01-1%的BSA，质量浓度为0.01%-1%的吐温20、质量浓度为0.1%-5%蔗糖，以及质量浓度为0.01-1%的NaN3；更优选地，所述处理液由以下组成成分组成：工作浓度为0.01M、pH为7.5-8.0的Tris–HCl缓冲液，质量浓度为0.05-0.5%的BSA，质量浓度为0.1%-0.5%的吐温20、质量浓度为3%蔗糖，以及质量浓度为0.05%的NaN3。5.根据权利要求3所述的胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，所述样品垫和结合垫由单一的玻璃纤维膜构成，采用喷球工艺将荧光微球标记的胱抑素C单克隆抗体直接喷涂至所述玻璃纤维膜上，形成胱抑素C抗体-荧光微球结合区。6.根据权利要求3所述的胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，所述样品垫和结合垫分别由不同的玻璃纤维膜构成，采用铺球工艺将荧光微球标记的胱抑素C单克隆抗体直接铺至所述玻璃纤维膜上，形成结合垫。7.根据权利要求1所述的胱抑素C荧光微球免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，所述荧光微球标记的胱抑素C单克隆抗体由以下方法制备获得：将荧光微球和E...

【专利技术属性】
技术研发人员：王云龙，徐瑞芳，李玉林，王继创，
申请(专利权)人：河南省生物工程技术研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41