一种联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条制造技术

本发明专利技术公开了一种联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条，包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，结合垫上固定有抗人白蛋白单克隆抗体‑荧光微球复合物、胱抑素C配对单克隆抗体‑荧光微球复合物、羊抗兔IgG‑荧光微球复合物；抗人白蛋白单克隆抗体‑荧光微球复合物是由抗人白蛋白单克隆抗体与荧光微球通过EDC、NHS两步法偶联形成,胱抑素C单克隆抗体‑荧光微球复合物是由胱抑素C单克隆抗体与荧光微球通过EDC、NHS两步法偶联形成,羊抗兔IgG‑荧光微球复合物是由羊抗兔IgG与荧光微球通过EDC一步法偶联形成。本发明专利技术提供一种操作简便、快速检测、灵敏度高、成本低廉，且适合床旁快速检测的联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条。

A test strip for combined quantitative detection of urinary microalbumin and cystatin C

The invention discloses a test strip for combined quantitative detection of urinary microalbumin and cystatin C, including a bottom plate, a sample pad, a binding pad, a cellulose nitrate membrane and a water absorbent pad, on which a monoclonal antibody against human albumin, a fluorescent microsphere complex, a cystatin C paired monoclonal antibody, a fluorescent microsphere complex, and a water absorbent pad are fixed. Sheep anti-rabbit IgG fluorescent microsphere complex; anti-human albumin Monoclonal antibody fluorescent microsphere complex is formed by coupling of anti-human albumin Monoclonal Antibody and fluorescent microsphere through EDC and NHS two-step method. Cystatin C monoclonal antibody fluorescent microsphere complex is composed of cystatin C monoclonal antibody and fluorescent microsphere through EDC and NHS two-step method. The sheep anti-rabbit IgG fluorescent microsphere complex was formed by one-step EDC coupling of sheep anti-rabbit IgG and fluorescent microspheres. The invention provides a test strip with simple operation, rapid detection, high sensitivity, low cost, and suitable for rapid bedside detection of urine microalbumin and cystatin C.

【技术实现步骤摘要】
一种联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条
本专利技术涉及疾病诊断
，具体涉及一种联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条。
技术介绍
肾脏的生理功能主要是排泄代谢废物及调节水、电解质酸碱平衡，分泌多种活性物质，维持机体内环境稳定，以保证机体的正常生理功能。近年来由于生活习性、饮食结构等的变化，使高血压、糖尿病等发病率呈现逐步增高趋势。而这些疾病很容易累及肾脏，导致肾脏功能损伤，但由于肾脏有较强的代偿能力，在早期并没有明显的临床特征，往往被人们所忽视，当出现明显症状时已处于中晚期，对患者的治疗及预后带来很大影响。早诊断、早治疗以逆转损伤的肾功能是唯一能阻止肾脏疾病恶化的方法。因此，肾功能损伤的早期筛查诊断就显得尤为重要。长期用于肾功能损伤检测的体系包括肾小球损伤标志物、肾小管损伤标志物和肾小球滤过率标志物等，这些生物标志物的检测对协助肾脏疾病的早期诊断治疗和预后的评价具有重要意义。肾小球滤过率是评价肾功能损伤最简便的方法，众所周知，其评价指标有外源性标志物和内源性标志物。外源性指标包括菊粉清除率和放射性核素物质测定，菊粉经肾小球滤过，无肾小管重吸收和分泌，可准确反映肾小球滤过功能，被称为“金标准”，但菊粉清除率检测不方便，尤其需要静脉输注，而且菊粉清除还可能受血糖影响；放射性标志物清除率检测价格昂贵，标本需特殊处理和放射显影，某些患者（如妊娠早期妇女）不宜接受而限制其应用。内源性指标包括肌酐、尿素、尿酸和一些低分子量蛋白等，它们不同程度的受一些肾前性或肾性因素干扰。目前临床常用检测肌酐、尿素等来评估肾功能受损情况，其存在敏感性低的缺点，当肾小球滤过率降至正常的50%时，肌酐、尿素值仍在正常范围内；肾小球滤过率降至正常的1/3时，肌酐、尿素会迅速增高，且肾小球滤过率降低和肌酐、尿素升高之间无线性关系，故肌酐、尿素并不能很好的反映早期肾功能损伤情况。肾小球早期损伤主要表现为肾小球滤过膜的屏障作用受损，在尿中可检出微量蛋白。目前研究最多的是白蛋白。人体代谢正常情况下，尿中的白蛋白极少，每升尿液中白蛋白不超过20mg，所以称尿微量白蛋白。当尿中的微量白蛋白在20-200mg/L范围内，就属于微量白蛋白尿。肾脏是人体重要的排泄器官，糖尿病、高血压、某些自身免疫疾病等都能导致肾脏损伤，而在这些病人发展成明显肾脏损伤之前要经过一个初始的肾脏损伤也就是微量白蛋白尿阶段。早期肾损伤即微量白蛋白尿阶段的病人常无临床症状，且尿常规检查正常，此时进行早期治疗是可以逆转的。因此，尿微量白蛋白对早期肾功能损伤诊断具有重要意义。肾小管标记蛋白可分为3类：肾小管上皮细胞的各种酶（统称尿酶）、低分子量蛋白和各段肾小管脱落的抗原性物质。胱抑素C是一种小分子量的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，非糖基化的碱性蛋白，相对分子质量为13.3kD，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定，只能通过肾小球滤过，完全被肾小管上皮细胞重吸收并于细胞内降解，不受肾外其他因素（如性别、年龄、饮食、炎性反应等）的干扰，且当肾功能早期受损时，尿胱抑素C浓度将迅速增加至100倍之多。因此，通过检测尿液胱抑素C浓度可以为肾功能损伤提供一个敏感而又准确可靠的评价指标，对肾病患者早期肾损害的发现有重要临床价值。可见，准确的检测尿液中微量白蛋白和胱抑素C的含量对多种肾脏疾病的早期筛查诊断有重要的参考价值和临床意义。中国专利文件201610227990.1提出了“一种高性能的人尿液微量白蛋白检测试剂盒”，201320022738.9提出了“一种检测胱抑素C的试纸条”，现有技术中虽然有检测尿液微量白蛋白或胱抑素C的设备，但两者联合检测的设备却没有，且若能实现尿微量白蛋白和胱抑素C的联合检测，不仅操作简便而且能够提高肾功能损伤检出率，可有效的为临床高血压、糖尿病等导致的早期肾功能损伤提供重要的参考依据。目前，市售尿微量白蛋白和尿胱抑素C的检测方法主要有：免疫比浊法，化学发光法，酶联免疫荧光法（ELISA），它们的灵敏度都较高，易于实现自动化。但它们对实验室及操作人员水平要求较高，且费用较昂贵，难以在基层医院开展，且操作不够简便迅速、不能实现快速床旁检测。即时检验是体外诊断行业的子行业，是近几年体外诊断行业重要的发展方向和增长最快的领域。随着荧光材料学的发展，以免疫层析原理为基础同时结合荧光物质特性的荧光免疫层析技术已逐渐成为当前快速检测发展的重要方向。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述问题，提供一种操作简便、快速检测、灵敏度高、成本低廉，且适合于床旁快速检测的联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条，其中尿液微量白蛋白采用竞争法反应模式，尿液胱抑素C采用双抗体夹心法。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案具体如下：一种联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条，包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接组装在底板上，其中，吸水垫和结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区；样品垫交叠压在结合垫上，所述结合垫上固定有抗人白蛋白单克隆抗体-荧光微球复合物、胱抑素C配对单克隆抗体-荧光微球复合物、羊抗兔IgG-荧光微球复合物；所述检测区内的硝酸纤维素膜上包被有人白蛋白抗原、胱抑素C单克隆抗体和兔IgG多克隆抗体，分别构成检测线T1、检测线T2和质控线C；所述抗人白蛋白单克隆抗体-荧光微球复合物是由抗人白蛋白单克隆抗体与荧光微球通过EDC、NHS两步法偶联形成,所述胱抑素C单克隆抗体-荧光微球复合物是由胱抑素C单克隆抗体与荧光微球通过EDC、NHS两步法偶联形成,所述羊抗兔IgG-荧光微球复合物是由羊抗兔IgG与荧光微球通过EDC一步法偶联形成。优选的，所述荧光微球是羧基荧光微球的一种。优选的，所述抗人白蛋白单克隆抗体-荧光微球复合物的制备过程为：（1）将荧光微球置于0.05M硼酸缓冲液缓冲液中进行偶联，并加0.01MEDC和0.02MNHS缓冲液进行活化；（2）将步骤（1）所得已活化的荧光微球洗涤除去EDC、NHS，加入0.05M硼酸缓冲液，再加入抗人白蛋白单克隆抗体后于25~30℃下反应2h，离心，得沉淀物；（3）将步骤（2）所得沉淀物用保护液重悬，用封闭液封闭1h，即得。优选的，所述胱抑素C单克隆抗体-荧光微球复合物的制备过程为：（1）将荧光微球置于0.05M硼酸缓冲液中进行偶联，并加0.01MEDC和0.02MNHS缓冲液进行活化；（2）将步骤（1）所得已活化的荧光微球洗涤除去EDC、NHS，加入0.05M硼酸缓冲液，再加入胱抑素C单克隆抗体后于25~30℃下反应2h，离心，得沉淀物；（3）将步骤（2）所得沉淀物用保护液重悬，用封闭液封闭1h，即得。优选的，所述羊抗兔IgG-荧光微球复合物的制备过程为：（1）将荧光微球置于0.05M硼酸缓冲液中进行偶联，并加0.01MEDC缓冲液进行活化；（2）将步骤（1）所得已活化的荧光微球洗涤除去EDC，加入0.05M硼酸缓冲液，再加入羊抗兔IgG后于25~30℃下反应1.5h后离心，得沉淀物；（3）将步骤（2）所得沉淀物用保护液重悬，用封闭液封闭30min，即得。优选的，步骤（3）中所述保护液由0.04M、pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条，其特征在于，包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接组装在底板上，其中，吸水垫和结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区；样品垫交叠压在结合垫上，所述结合垫上固定有抗人白蛋白单克隆抗体‑荧光微球复合物、胱抑素C配对单克隆抗体‑荧光微球复合物、羊抗兔IgG‑荧光微球复合物；所述检测区内的硝酸纤维素膜上包被有人白蛋白抗原、胱抑素C单克隆抗体和兔IgG多克隆抗体，分别构成检测线T1、检测线T2和质控线C；所述抗人白蛋白单克隆抗体‑荧光微球复合物是由抗人白蛋白单克隆抗体与荧光微球通过EDC、NHS两步法偶联形成, 所述胱抑素C单克隆抗体‑荧光微球复合物是由胱抑素C单克隆抗体与荧光微球通过EDC、NHS两步法偶联形成,所述羊抗兔IgG‑荧光微球复合物是由羊抗兔IgG与荧光微球通过EDC一步法偶联形成。

【技术特征摘要】
1.一种联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条，其特征在于，包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接组装在底板上，其中，吸水垫和结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区；样品垫交叠压在结合垫上，所述结合垫上固定有抗人白蛋白单克隆抗体-荧光微球复合物、胱抑素C配对单克隆抗体-荧光微球复合物、羊抗兔IgG-荧光微球复合物；所述检测区内的硝酸纤维素膜上包被有人白蛋白抗原、胱抑素C单克隆抗体和兔IgG多克隆抗体，分别构成检测线T1、检测线T2和质控线C；所述抗人白蛋白单克隆抗体-荧光微球复合物是由抗人白蛋白单克隆抗体与荧光微球通过EDC、NHS两步法偶联形成,所述胱抑素C单克隆抗体-荧光微球复合物是由胱抑素C单克隆抗体与荧光微球通过EDC、NHS两步法偶联形成,所述羊抗兔IgG-荧光微球复合物是由羊抗兔IgG与荧光微球通过EDC一步法偶联形成。2.根据权利要求1所述联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条，其特征在于，所述荧光微球是羧基荧光微球的一种。3.根据权利要求1所述联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条，其特征在于，所述抗人白蛋白单克隆抗体-荧光微球复合物的制备过程为：（1）将荧光微球置于0.05M硼酸缓冲液缓冲液中进行偶联，并加0.01MEDC和0.02MNHS缓冲液进行活化；（2）将步骤（1）所得已活化的荧光微球洗涤除去EDC、NHS，加入0.05M硼酸缓冲液，再加入抗人白蛋白单克隆抗体后于25~30℃下反应2h，离心，得沉淀物；（3）将步骤（2）所得沉淀物用保护液重悬，用封闭液封闭1h，即得。4.根据权利要求1所述联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条，其特征在于，所述胱抑素C单克隆抗体-荧光微球复合物的制备过程为：（1）将荧光微球置于0.05M硼酸缓冲液中进行偶联，并加0.01MEDC和0.02MNHS缓冲液进行活化；（2）将步骤（1）所得已活化的荧光微球洗涤除去EDC、NHS，加入0.05M硼酸缓冲液，再加入胱抑素C单克隆抗体后于25~30℃下反应2h，离心，得沉淀物；（3）将步骤（2）所得沉淀物用保护液重悬，用封闭液封闭1h，即得。5.根据权利要求1所述联合定量检测尿液微量白蛋白和胱抑素C的试纸条，其特征在于，所述羊抗兔IgG-荧光微球复合物的制备过程为：（1）将荧光微球置于0.05M硼酸缓冲液中进行偶联，并加0.01MEDC缓冲液进行活化；（2）将步骤（1）所得已活化的荧光微球洗涤除去EDC，加入0.05M硼酸缓冲液，再加入羊抗兔IgG后于25~3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王云龙，银芳颖，李玉林，王继创，程蕾，王敏，
申请(专利权)人：河南省生物工程技术研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41