检测植物中茉莉酸含量以及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量的酶联免疫吸附分析方法技术

本发明专利技术公开了一种检测植物样品中茉莉酸（JA）含量以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）总含量的酶联免疫吸附分析方法（ELISA）。其特点是运用杂交瘤技术，成功制备了一种对茉莉酸甲酯（MeJA）具有高灵敏度及高特异性的单克隆抗体，建立了以茉莉酸甲酯（MeJA）为检测目标物的间接竞争ELISA。该方法检测茉莉酸甲酯（MeJA）的灵敏度（IC50值）为2.02 ng/mL，检出限（LOD值）为0.20 ng/mL。本发明专利技术所建立的检测植物样品中茉莉酸类植物激素含量的方法具有高灵敏、高特异、快速、样品用量小、高通量的特点，为深入研究茉莉酸类植物激素的生理效应等提供了强有力的分析检测方法。

【技术实现步骤摘要】
检测植物中茉莉酸含量以及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量的酶联免疫吸附分析方法一、
本专利技术涉及一种检测植物中茉莉酸(JA)含量以及茉莉酸和茉莉酸甲酯(JAs)总含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，属于分析化学的研究领域。二、
技术介绍
以茉莉酸(jasmonicacid,JA)和茉莉酸甲酯(methyljasmonate,MeJA)为典型代表的茉莉酸类植物激素(jasmonates,JAs)是一种新型天然植物生长调节剂，具有广谱的生理效应，普遍存在于多种高等植物体内。作为天然的内源植物激素，JA和MeJA都可以控制信号转导和调节生长，具有在分子、细胞、器官和个体等水平调节植物生长发育的多种生理效应。通过茉莉酸类激素(JAs)的响应转录因子的自身调节，JAs在植物次生代谢物的积累中起着重要作用，这些次生代谢物是药物、食品添加剂和精细化学品的重要资源。此外，茉莉酸类激素(JAs)被认为在生物和非生物防御反应中起着关键作用，也参与了一些病原体引起的防御反应。已有研究表明，茉莉酸类信号分子可作为环境信号分子有效地介导植物对病原菌、食草动物及非生物胁迫等的防御反应，诱导一系列防御基因的表达、防御反应化学物质的合成，并调节植物的“免疫”和应激反应。JAs与其他植物信号分子的拮抗或协同相互作用可调节防御和应激响应基因表达，以响应生物和非生物胁迫。另外，茉莉酸类激素(JAs)对子叶气孔发育具有一定的调控作用，其中子叶是促进植物与环境间气体、水汽交换的重要通道。因此，作为内源性信号分子，茉莉酸类激素(JAs)生理效应在植物中极为复杂。茉莉酸类激素(JAs)还可以作为外源激素使用，也可以通过形态学和生理变化的形式发挥抑制或促进（诱导）的各种作用。大多数外源性的JA或MeJA是合成的，而后者很容易从香水行业获得，这无疑增加了JAs的商业价值。据报道，外源性MeJA的应用可以大大提高植物的防御能力，使植物抗咀嚼昆虫的死亡率从80%降低到12%左右。外源JAs也参与调控水果蔬菜的营养质量，包括调控番茄红素、花青素等一系列次生代谢物的含量。但是，内源性JAs对植物生长的确切机制和作用有待进一步的发现和验证。外源性JAs引起的内源性JAs的变化仍需探索，这对指导农业生产具有现实意义。然而，JAs在植物体内含量（µg~ng/g鲜重）很低和周围杂质干扰很多，导致其分析方法的灵敏度受到限制。因此，建立一种特异性强、灵敏度高的内源性信号化合物测定方法具有重要的意义。随着分离和分析技术的发展，各种定性和定量分析方法在JAs的分析方面得到了应用，包括放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱仪(GC/MS)、液相色谱-质谱联用法(LC/MS)、液相色谱-质谱联用法(LC/MS/MS)、超高效液相色谱-电喷雾-电离质谱联用法(UPLC/ESI-MS)等等。与常规仪器法相比，免疫分析法价格低廉、操作简单、方法灵敏，仅需要少量植物样品，而且它有很强的抗干扰能力。酶联免疫吸附分析方法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、分析快速的优点，已经广泛用于临床、药物、食品和环境等分析领域。到目前为止，有关植物中茉莉酸类激素的免疫分析方法的论文很少，也只有为数不多的仪器方法可做到同时检测植物中茉莉酸和茉莉酸甲酯。本方法建立了高灵敏高特异测定植物中茉莉酸含量以及茉莉酸与茉莉酸甲酯总含量的以单克隆抗体为基础的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，为茉莉酸类植物激素的进一步研究奠定了坚实的基础。三、
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足而提供一种测定植物中JA含量以及JA与MeJA总含量(JAs)的单克隆抗体为基础的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，其特点是基于抗原与抗体之间特异性反应而建立的分析方法。测定植物中JA含量以及JA与MeJA总含量(JAs)的单克隆酶联免疫吸附分析方法。（1）免疫原和包被抗原的制备由于茉莉酸分子上有羧基，故可通过碳二亚胺法直接将茉莉酸与载体蛋白相连。将茉莉酸(JA)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，二环己基碳二亚胺(DCC)一同溶于二甲基甲酰胺中(DMF)，充分活化，低温离心取上层清液。后将上清缓慢加入到牛血清白蛋白即BSA或卵清白蛋白即OVA中，充分反应后，离心取上层清液，透析，冷冻干燥，保存待用。投料比n(JA)=n(NHS)=n(DCC)，小分子与载体蛋白的比值在20~70。其中，JA-BSA为免疫原，JA-OVA为包被抗原。（2）单克隆抗体的制备免疫：第一次免疫，将免疫原溶于生理盐水中，再与等体积的福氏完全佐剂混合，皮下多点免疫BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原剂量在50~100μg；两周后第二次免疫，将福氏完全佐剂换成福氏不完全佐剂，其余步骤相同；两周后第三次免疫，重复第二次免疫操作，后一周，尾部取血ELISA检测抗血清效价；取血两周后第四次免疫，重复第三次免疫步骤并取血测效价；取血两周后最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂。融合：腹腔加强免疫三天后取小鼠脾脏，将脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）按5:1~10:1的比例混合，在50%聚乙二醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用HAT培养液混悬，加入预先含有饲养细胞的96孔培养板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。筛选：融合后2周左右，用间接ELISA法筛选，将阴性孔无色或接近无色，而阳性孔明确显色的细胞用有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测。单克隆抗体的大量生产：腹腔注射福氏不完全佐剂致敏BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情况，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水。多次离心取澄清腹水即作为单克隆抗体，单抗与甘油以及磷酸缓冲溶液(PB)4：5：1混合并置于-20℃保存。（3）建立测定茉莉酸甲酯的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)优化多个实验条件，在最佳条件的基础上，绘制出标准曲线。结果表明，该单克隆抗体对茉莉酸甲酯(MeJA)的特异性以及灵敏度(IC50)优于对茉莉酸(JA)。在此发现上建立了以单克隆抗体为基础以茉莉酸甲酯(MeJA)为实际检测对象的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)。（4）ELISA对植物样品中茉莉酸的含量及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量的测定①样品提取方法本专利技术根据检测目标物的不同设计了两种不同的样品提取方法，分别用于检测植物样品中的茉莉酸含量（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量（JAs）。检测植物中茉莉酸含量（JA）的提取方法：参考NY/T2871-2015方法并稍作修改。新鲜植物材料(0.5g)剪碎后于2mL预冷的80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）中4℃下浸提16小时。（然后加入一定的JA标准溶液，形成一系列加标样品。）离心后，残渣中再次加入80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）复提2小时。再次离心取上清，合并上清液，用甲酸调节pH至2.5-3.0，后上Sep-PakC18小柱(Waters,Milford,USA)。上柱前用2mL20%甲醇水溶液（甲醇-水：20-80，v/v）活化平衡小柱。上样后按以下步骤：①用2mL1%甲酸水溶液（1mL甲酸加水至100mL）淋洗；②用2mL甲醇淋洗；③用2mL0.5%氨水甲醇（0.5mLNH4OH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）总含量的酶联免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于该方法包括以下步骤：步骤一：免疫原和包被抗原的制备；步骤二：单克隆抗体的制备；步骤三：建立测定茉莉酸甲酯的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)；步骤四：ELISA对植物样品中茉莉酸的含量及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量的测定。

【技术特征摘要】
1.一种检测植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）总含量的酶联免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于该方法包括以下步骤：步骤一：免疫原和包被抗原的制备；步骤二：单克隆抗体的制备；步骤三：建立测定茉莉酸甲酯的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)；步骤四：ELISA对植物样品中茉莉酸的含量及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量的测定。2.根据权利要求1所述的一种检测植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）总含量的酶联免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于，所述的免疫原和包被抗原的制备具体步骤为：由于茉莉酸分子上有羧基，故可通过碳二亚胺法直接将茉莉酸与载体蛋白相连，将茉莉酸（JA），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），二环己基碳二亚胺（DCC）一同溶于二甲基甲酰胺中（DMF），充分活化，低温离心取上层清液，后将上清缓慢加入到牛血清白蛋白即BSA或卵清白蛋白即OVA中，充分反应后，离心取上层清液，透析，冷冻干燥，保存待用，投料比n(JA)=n(NHS)=n(DCC)，小分子与载体蛋白的比值在20~70，其中，JA-BSA为免疫原，JA-OVA为包被抗原。3.茉莉酸（JA）根据权利要求1所述的一种检测植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）总含量的酶联免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于，所述的单克隆抗体的制备具体步骤为：免疫：第一次免疫，将免疫原溶于生理盐水中，再与等体积的福氏完全佐剂混合，皮下多点免疫BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原剂量在50~100μg；两周后第二次免疫，将福氏完全佐剂换成福氏不完全佐剂，其余步骤相同；两周后第三次免疫，重复第二次免疫操作，后一周，尾部取血ELISA检测抗血清效价；取血两周后第四次免疫，重复第三次免疫步骤并取血测效价；取血两周后最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂；融合：腹腔加强免疫三天后取小鼠脾脏，将脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）按5:1~10:1的比例混合，在50%聚乙二醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用HAT培养液混悬，加入预先含有饲养细胞的96孔培养板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；筛选：融合后2周左右，用间接ELISA法筛选，将阴性孔无色或接近无色，而阳性孔明确显色的细胞用有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测；单克隆抗体的大量生产：腹腔注射福氏不完全佐剂致敏BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情况，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水，多次离心取澄清腹水即作为单克隆抗体，单抗与甘油以及磷酸缓冲溶液（PB）4：5：1混合并置于-20℃保存。4.根据权利要求1所述的一种检测植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）总含量的酶联免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于，所述的建立测定茉莉酸甲酯的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)具体步骤为：优化多个实验条件，在最佳条件的基础上，绘制出标准曲线，结果表明，该单克隆抗体对茉莉酸甲酯（MeJA）的特异性以及灵敏度（IC50）优于对茉莉酸（JA），在此发现上建立了以单克隆抗体为基础以茉莉酸甲酯（MeJA）为实际检测对象的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)。5.根据权利要求1所述的一种检测植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵林川，
申请(专利权)人：苏州科铭生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32