一种肿瘤靶向药物及其制备方法技术

本发明专利技术涉及靶向药物递送领域，具体涉及一种肿瘤靶向药物及其制备方法。该肿瘤靶向药物，包括靶向载体和装载于所述载体的抗肿瘤药，所述靶向载体为包括乙肝病毒样颗粒和RGD序列的重组蛋白。本发明专利技术的肿瘤靶向药物可通过基因工程的方法获得，操作简单。本发明专利技术的肿瘤靶向药物靶向性好、生物利用度高、副作用小。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤靶向药物及其制备方法
本专利技术涉及靶向药物递送领域，具体涉及一种肿瘤靶向药物及其制备方法。
技术介绍
靶向药物是当前抗肿瘤药物研究的热点，目前常见的小分子靶向药物大多通过将小分子药物与蛋白类纳米载体或高分子纳米载体通过化学修饰得到，制备过程复杂，且高分子纳米载体的生物相容性差，可能会对体内正常细胞造成影响。乙肝核心蛋白病毒样颗粒是不含病毒核酸的空壳结构，许多病毒结构蛋白都具有自动组装成VLPs的能力，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。由于VLPs不含有病毒遗传物质，因此不具有感染性，其中有些已经作为疫苗成功应用于临床。VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并将外源性抗原展示在其表面。乙肝病毒核心抗原(HBcAg)在1987年被第一次用作外源抗原病毒样颗粒载体。用于HBcAg表达的表达系统具有多样化，包括原核表达系统、哺乳动物细胞表达系统、转基因植物表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统等，并且都能达到较高产量，形成天然颗粒状结构。由大肠杆菌表达系统表达产生的HBcAg主要有两种颗粒大小，一种包括180个亚基(T＝3，T＝Triangulationnumber)，另外一种包括240个亚基(T＝4)，部分颗粒中包裹大肠杆菌核酸。每个形成颗粒的亚基都是由HBcAg单体形成的二聚体，构成颗粒外部的刺突。两个HBcAg单体通过二硫键形成一个亚基，每个HBcAg单体有4个Cys残基，包括Cys48、Cys61、Cys107、Cys183。其中Cys107包裹在颗粒内部；Cys48部分参与单体间二硫键形成，剩下的残基游离在颗粒表面；而Cys61和Cys183则全部参与单体间或二聚体之间二硫键形成，和野生型的HBcAg具有同样的结合方式。对于全长183个氨基酸的HBcAg来说，前144个氨基酸属于颗粒装配区，主要功能和病毒颗粒状形成有关。而第145～183个氨基酸属于核酸结合区富含精氨酸，具有三个重复的SPRRR结构，主要作用是结合病毒核酸并将其包裹至病毒颗粒内部对病毒核酸起到保护和提供复制场所的功能。HBcAg氨基酸序列中第78～82个氨基酸之间是主要免疫区域(MajorImmunodominantRegion，MIR)，这个区域呈现在颗粒表面刺突的顶部；第127～133个氨基酸在主要刺突旁边形成一个小的刺突，这两部分为HBcAg表面的主要B细胞识别位点。MIR区域由于分布在颗粒表面的刺突顶部，具有易于与受体结合和不影响外源片段自然构象的优点。对于HBcAg单体的N末端和C末端而言，插入片段时需要考虑是否呈现在颗粒表面、是否影响颗粒结构组装和插入片段是够能保持天然构象这三方面问题。C末端在144个氨基酸之后插入小片段序列不会影响颗粒自组装，但是插入片段的大小对插入片段是否能正确折叠和是够能呈现在颗粒表面有很大影响。N末段插入外源序列要保持序列正确构象和颗粒表面呈现比较困难，所以对插入片段大小有严格的限制。用结构比较松散的截短型即前144个氨基酸形成的颗粒，可以提高N末端插入片段呈现在颗粒表面的可能性。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种更易被肿瘤细胞摄取、生物相容性好的肿瘤靶向药物。本专利技术还提供了一种更加高效、简单的肿瘤靶向药物的制备方法。本专利技术的肿瘤靶向药物采用如下技术方案：一种肿瘤靶向药物，包括靶向载体和装载于所述载体的抗肿瘤药，所述靶向载体为包括乙肝病毒样颗粒和RGD序列的重组蛋白。优选的，所述乙肝病毒样颗粒包括144个氨基酸，其C端的第78-82位氨基酸用RGD序列替代，所述RGD序列两端分别通过连接肽与所述乙肝病毒样颗粒C端的第77和83位氨基酸相连。优选的，所述连接肽的氨基酸序列为GTSGSSGSGSGGSGSGGGG。优选的，所述抗肿瘤药为疏水性药物。优选的，所述抗肿瘤药为蒽环霉类药物，选自阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表阿霉素和阿克拉霉素及其药用衍生物中的任意一种或几种。优选的，所述靶向载体还包括pH敏感多肽，所述pH敏感多肽与所述乙肝病毒样颗粒C末端相连；所述pH敏感多肽为聚组氨酸多肽，所述聚组氨酸多肽由5-15个组氨酸组成。如上所述的肿瘤靶向药物的制备方法，包括如下步骤：(1)通过基因合成法获得编码所述靶向载体的基因序列，并通过XhoI/NdeI酶切位点构建到表达载体质粒pEt43.1(a)中；(2)使步骤(1)得到的载体质粒在大肠杆菌中表达目的蛋白；(3)分离纯化目的蛋白即得所述靶向载体；(4)向步骤(3)得到的靶向载体装载抗肿瘤药。编码所述靶向载体的基因序列按照如下方式获取：获取编码乙肝病毒样颗粒C端144个氨基酸的基因序列，将编码RGD序列的基因序列两端分别连接编码连接肽的基因序列并插入到编码乙肝病毒样颗粒C端78-82位氨基酸的基因序列之间，最后也可根据选择在编码乙肝病毒颗粒C端144个氨基酸的基因序列的末尾连接上编码聚组氨酸多肽的基因序列，即得所述编码靶向载体的基因序列。优选的，向靶向载体装载抗肿瘤药包括如下步骤：(1)解离：将所述靶向载体置于解离液中在4℃下孵育；(2)重组：将经步骤(1)解离后得到的靶向载体溶液移入分子量为8000～14000Da的透析袋中并置于重组缓冲液中进行重组；(3)抗肿瘤药装载：将经步骤(2)处理得到的靶向载体与解离液在4℃下孵育，孵育结束加入抗肿瘤药物，轻微震荡，继续培养0.5-4h；所述经步骤(2)处理得到的靶向载体与所述抗肿瘤药的摩尔比为1︰(50～10000)；(4)将步骤(3)得到的混合溶液移至分子量为8000～14000Da的透析袋中并置于重组缓冲液中透析，即得所述肿瘤靶向药物。优选的，所述重组的具体步骤为：将分子量为8000～14000Da的透析袋置于重组缓冲液1中并在4℃下过夜透析，将透析液更换为重组缓冲液2，透析时间总共为48h，期间更换缓冲液2次。优选的，所述解离液包括30-60mMpH8.0Tris-HCl、120-160mMNaCl和6.0-10.0M的尿素；所述重组缓冲液1包括35-60mMpH8.0Tris-HCl、120-165mMNaCl、6-15％甘油和0.5-2％甘氨酸，所述重组缓冲液2包括35-60mMpH8.0Tris-HCl、120-165mMNaCl和0.5-2％甘氨酸，上述任意一种组分的浓度均为终浓度。本专利技术的有益效果是：本专利技术的肿瘤靶向药物的载体为包括乙肝病毒样颗粒和RGD序列的30-40nm的重组纳米蛋白，乙肝病毒样颗粒为不包括核酸的纳米蛋白类物质，具备自组装特性，RGD序列可与肿瘤细胞表面的整合素受体特异性结合，进而将抗肿瘤药物靶向运输至肿瘤细胞表面；且该载体本身即为蛋白类，易于在体内生物降解。本专利技术的肿瘤靶向药物载体通过将乙肝病毒的核酸去除，使其失去增殖和感染的能力，选择C端的144个氨基酸，并将第78-82位氨基酸之间的主要抗原决定簇(免疫区域)用肿瘤靶向RGD序列替代，不仅可使所述抗肿瘤药物具备靶向性，也可一定程度上避免乙肝病毒样颗粒对机体造成的免疫反应。由于聚组氨酸多肽具有酸响应作用，通过在所述乙肝假病毒颗粒C端的末尾连接聚组氨酸多肽，可使所述肿瘤靶向药物载体具有酸响应性，在微酸性环境中(肿瘤组织pH值即为若酸性)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤靶向药物，其特征在于，包括靶向载体和装载于所述靶向载体的抗肿瘤药，所述靶向载体为包括乙肝病毒样颗粒和RGD序列的重组蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤靶向药物，其特征在于，包括靶向载体和装载于所述靶向载体的抗肿瘤药，所述靶向载体为包括乙肝病毒样颗粒和RGD序列的重组蛋白。2.根据权利要求1所述的肿瘤靶向药物，其特征在于，所述乙肝病毒样颗粒包括144个氨基酸，其C端的第78-82位氨基酸用RGD序列替代，所述RGD序列两端分别通过连接肽与所述乙肝病毒样颗粒C端的第77和83位氨基酸相连。3.根据权利要求2所述的肿瘤靶向药物，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为GTSGSSGSGSGGSGSGGGG。4.根据权利要求1所述的肿瘤靶向药物，其特征在于，所述抗肿瘤药为疏水性药物。5.根据权利要求4所述的肿瘤靶向药物，其特征在于，所述抗肿瘤药为蒽环霉类药物，选自阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表阿霉素和阿克拉霉素及其药用衍生物中的任意一种或几种。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的肿瘤靶向药物，其特征在于，所述靶向载体还包括pH敏感多肽，所述pH敏感多肽连接在所述乙肝病毒样颗粒C端末尾；所述pH敏感多肽为聚组氨酸多肽，所述聚组氨酸多肽由5-15个组氨酸组成。7.根据权利要求1-6中任意一项所述的肿瘤靶向药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)通过基因合成法获得编码所述靶向载体的基因序列，并通过XhoI/NdeI酶切位点构建到表达载体质粒pEt43.1(a)中；(2)使步骤(1)得到的载体质粒在大肠杆菌中表达目的蛋白；(3)分离纯化目的蛋白即得所述靶向载体；(4)向步骤(3)得到的靶向载体装载抗肿瘤药。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王云龙，方蕊，李玉林，王继创，张怡青，邓黎黎，
申请(专利权)人：河南省生物工程技术研究中心有限公司，河南省生物工程技术研究中心，
类型：发明
国别省市：河南,41