抗核抗体靶抗原偶联物试剂、其制备方法、包含其的试剂盒及应用技术

本发明专利技术提供了一种抗核抗体靶抗原偶联物试剂、其制备方法、包含其的试剂盒及应用。其中，抗核抗体靶抗原偶联物试剂包括抗原‑磁性微球偶联物，抗原‑磁性微球偶联物包括细胞提取物靶抗原包被磁性微球形成的第一偶联物以及纯化靶抗原包被磁性微球形成的第二偶联物。通过将自身免疫性疾病相关的多种纯化靶抗原包被磁性微球，并辅以包被细胞提取物的磁性微球，这样形成的抗核抗体靶抗原与磁球的偶联物，与单纯用混合的纯化靶抗原包被磁性微球的偶联物相比，具有更完整的抗原谱，能够提高阳性检出率，具有更好的临床检测灵敏度。与单纯包被细胞提取物的偶联物相比，能够极大地降低非特异性，提高检测特异性、灵敏度以及阳性检出率，同时减少假阳性。

【技术实现步骤摘要】
抗核抗体靶抗原偶联物试剂、其制备方法、包含其的试剂盒及应用
本专利技术涉及抗核抗体检测领域，具体而言，涉及一种抗核抗体靶抗原偶联物试剂、其制备方法、包含其的试剂盒及应用。
技术介绍
抗核抗体(antinuclearantibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取性核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称。传统定义是将针对细胞核内成分的抗体称为ANA，广义定义是针对细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。现在对ANA靶抗原的理解不再仅仅局限于核成分，已从细胞核扩大到整个细胞，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架等，一些ANA靶抗原成分(如SSA/RO、Jo-1、rRNP等)在核仁和胞浆内比核质内更丰富。ANA能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。抗核抗体的抗体主要为IgG型，也见于IgM、IgA，甚至LgD及LgE中。自身抗体的产生是自身免疫性疾病的基本特征之一，因而，自身抗体本身就成为大多数自身免疫性疾病的血清学标志物。现阶段，研究发现与ANA相关的自身免疫性疾病主要包括系统性红斑狼疮、混合型结缔组织疾病、干燥综合征、局限性系统硬化症、弥散性系统硬化症、多肌炎、皮肌炎和原发性胆汁性肝硬化，其中研究比较清楚与上述疾病密切相关的主要包括Sm/RNP、Sm、SSA、SSB、Scl-70、Jo-1、CENPB、dsDNA、核小体、组蛋白抗原、核糖体P蛋白和线粒体等靶抗原对应的抗体，随着新的与疾病相关的抗核抗体被鉴定而不断完善。ANA靶抗原主要是通过Hep-2或HeLa细胞提取，猪心组织或小牛胸腺组织提取，或者重组表达获得。由于细胞核中存在至少上百种ANA相对应的靶抗原，因此，ANA的检测非常复杂，在与ANA相关的自身免疫性疾病检测中，试剂的检测灵敏度和特异性对于临床疾病的诊断与判断具有重要意义。ANA的检测特异性与检测灵敏度与检测方法和核抗原的制备方法密切相关。目前，临床检测抗核抗体的常见方法主要包括间接免疫荧光法、免疫印迹法、斑点免疫结合法、酶联免疫吸附法、化学发光法等。现阶段间接免疫荧光发依然是ANA筛查金标准，一般通过将鼠肝细胞或者Hep-2细胞切片固定在载玻片作为靶抗原，Hep-2细胞具有核抗原丰富、特异性强、含量高等特征。使用Hep-2细胞制备的抗原片可以检测出一些鼠肝(肾)切片呈阴性或反应弱的样本，较传统的鼠肝(肾)切片具有更好的检测灵敏度。但该方法还处于最开始的间接免疫荧光技术，很难定量检测，也容易出现假阳性，检测灵敏度和特异性还有待提高，另外难以标准化和自动化。比如，现有技术有报道：通过显微图像灰度分析经过间接免疫荧光反应的Hep-2细胞核荧光片强度来表征人血清中均质性或斑点型抗核抗体的浓度。该方法能够很大程度上消除实验操作者判断的主观因素和检测仪器差异性带来的负面影响，从而使检测结果更精确和客观可行。但该方法使用间接免疫荧光技术，检测灵敏度和特异性还有待提高。酶联免疫吸附法、免疫印记法和斑点免疫结合法近些年在ANA检测中越来越广泛，该方法基本都是将多种纯抗原包被于为微孔板或者纤维膜上，该方法可以避免细胞质各种干扰，较间接免疫荧光发特异性更好，但是同样存在操作繁琐，准确度和精密度较差，检测项目组合有限，难以实现自动化和高通量检测以及阳性检出率偏低的缺陷。比如，现有技术还公开了一种利用免疫印迹法检测自身免疫性疾病相关抗核抗体谱的试剂盒及制备方法，该方法在硝酸纤维膜或尼龙膜条上平行固定15或17种天然或重组抗原，具有检测灵敏度高，特异性强，准确性好等优点。但是该方法膜条固定抗原并非完整抗原谱，因此，检测率会较较间接免疫荧光法低，临床检测灵敏度还有待提高。综上可知，临床检测常用的间接免疫荧光法很难定量检测，检测灵敏度较低，也容易出现假阳性，存在检测时间长，结果判断难，也难以标准化和自动化。此外，虽然靶抗原为全抗原谱，但是无法解决Hep2细胞裂解物中部分靶抗原含量极低，从而导致漏检，也无法避免细胞裂解物中细胞质等一些物质的干扰，从而容易导致假阳性。临床检测灵敏度和特异性均有待提高。而酶联免疫吸附法、免疫印记法和斑点免疫结合法基本都是将多种天然或重组纯抗原包被于为微孔板或者纤维膜条上，这些方法可以避免细胞质各种干扰，相较间接免疫荧光发特异性更好，但是同样存在操作繁琐，准确度和精密度较差，难以自动化和高通量检测的缺陷。而且，还容易出现部分阳性样本漏检，因而临床检测灵敏度还有待提高。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种抗核抗体靶抗原偶联物试剂、其制备方法、包含其的试剂盒及应用，以解决现有技术中的抗核抗体检测灵敏度相对较低的问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种抗核抗体靶抗原偶联物试剂，该抗核抗体靶抗原偶联物试剂包括抗原-磁性微球偶联物，其中抗原-磁性微球偶联物包括：细胞提取物靶抗原包被磁性微球形成的第一偶联物，以及纯化靶抗原包被磁性微球形成的第二偶联物。进一步地，第一偶联物中，细胞提取物靶抗原为HepG2细胞裂解抗原、Hep2细胞裂解抗原或Hela细胞裂解抗原中的任意一种；优选地，细胞提取物靶抗原与磁性微球的质量比为：70～200μg：1mg。进一步地，第二偶联物中，纯化靶抗原为天然抗原、重组抗原或合成肽中的任意一种或多种；优选地，纯化靶抗原包括双链DNA抗原、组蛋白抗原、核糖体P蛋白抗原、核糖核蛋白抗原、Smith抗原、干燥综合征A抗原、干燥综合征B抗原、DNA拓扑异构酶-I抗原、组氨酰转运RNA合成酶抗原、着丝粒抗原、线粒体抗原及核小体抗原；更优选地，双链DNA抗原：组蛋白抗原：核糖体P蛋白抗原：核糖核蛋白抗原：Smith抗原：干燥综合征A抗原：干燥综合征B抗原：DNA拓扑异构酶-I抗原：组氨酰转运RNA合成酶抗原：着丝粒抗原：线粒体抗原：核小体抗原：磁性微球的质量比为0.5～0.7μg：0.4～0.6μg：0.7～0.9μg：0.9～1.1μg：0.9～1.1μg：1.6～2μg：1.2～1.4μg：0.9～1.1μg：1.6～2μg：1.4～1.6μg：0.9～1.1μg：0.3～0.5μg：1mg。进一步地，抗原-磁性微球偶联物中，第一偶联物与第二偶联物的体积比为1:3～6。进一步地，抗核抗体靶抗原偶联物试剂为悬浮液，悬浮液还包括磷酸盐缓冲液，优选磷酸盐缓冲液的pH值为7.5，更优选磷酸盐缓冲液与抗原-磁性微球偶联物的体积比为10～30:1。进一步地，磁性微球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，优选磁性微球的粒径为0.1～5μm。根据本专利技术的第二个方面，提供了一种抗核抗体检测试剂盒，该试剂盒包括抗核抗体靶抗原，其中，抗核抗体靶抗原为上述任一种抗核抗体靶抗原偶联物试剂。进一步地，抗核抗体靶抗原偶联物试剂的浓度为0.5～2mg/mL；优选地，试剂盒还包括校准品、质控品、发光标记物标记的抗人免疫球蛋白抗体、试剂缓冲液以及样本稀释液中的任意一种或多种；更优选地，发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、异鲁米诺衍生物、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，抗人免疫球蛋白抗体为抗人IgA、抗人IgM、抗人IgG、抗人LgD或抗人LgE中的一种或多种；更优选地，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗核抗体靶抗原偶联物试剂，其特征在于，所述抗核抗体靶抗原偶联物试剂包括：抗原‑磁性微球偶联物，所述抗原‑磁性微球偶联物包括：细胞提取物靶抗原包被磁性微球形成的第一偶联物，以及纯化靶抗原包被磁性微球形成的第二偶联物。

【技术特征摘要】
1.一种抗核抗体靶抗原偶联物试剂，其特征在于，所述抗核抗体靶抗原偶联物试剂包括：抗原-磁性微球偶联物，所述抗原-磁性微球偶联物包括：细胞提取物靶抗原包被磁性微球形成的第一偶联物，以及纯化靶抗原包被磁性微球形成的第二偶联物。2.根据权利要求1所述的抗核抗体靶抗原偶联物试剂，其特征在于，所述第一偶联物中，所述细胞提取物靶抗原为HepG2细胞裂解抗原、Hep2细胞裂解抗原或Hela细胞裂解抗原中的任意一种；优选地，所述细胞提取物靶抗原与所述磁性微球的质量比为：70～200μg：1mg。3.根据权利要求1所述的抗核抗体靶抗原偶联物试剂，其特征在于，所述第二偶联物中，所述纯化靶抗原为天然抗原、重组抗原或合成肽中的任意一种或多种；优选地，所述纯化靶抗原包括双链DNA抗原、组蛋白抗原、核糖体P蛋白抗原、核糖核蛋白抗原、Smith抗原、干燥综合征A抗原、干燥综合征B抗原、DNA拓扑异构酶-I抗原、组氨酰转运RNA合成酶抗原、着丝粒抗原、线粒体抗原及核小体抗原；更优选地，所述双链DNA抗原：组蛋白抗原：核糖体P蛋白抗原：核糖核蛋白抗原：Smith抗原：干燥综合征A抗原：干燥综合征B抗原：DNA拓扑异构酶-I抗原：组氨酰转运RNA合成酶抗原：着丝粒抗原：线粒体抗原：核小体抗原：磁性微球的质量比为0.5～0.7μg：0.4～0.6μg：0.7～0.9μg：0.9～1.1μg：0.9～1.1μg：1.6～2μg：1.2～1.4μg：0.9～1.1μg：1.6～2μg：1.4～1.6μg：0.9～1.1μg：0.3～0.5μg：1mg。4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗核抗体靶抗原偶联物试剂，其特征在于，所述抗原-磁性微球偶联物中，所述第一偶联物与所述第二偶联物的体积比为1:3～6。5.根据权利要求4所述的抗核抗体靶抗原偶联物试剂，其特征在于，所述抗核抗体靶抗原偶联物试剂为悬浮液，所述悬浮液还包括磷酸盐缓冲液，优选所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.5，更优选所述磷酸盐缓冲液与所述抗原-磁性微球偶联物的体积比为10～30:1。6.根据权利要求1所述抗核抗体靶抗原偶联物试剂，其特征在于，所述磁性微球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，优选所述磁性微球的粒径为0.1～5μm。7.一种抗核抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括抗核抗体靶抗原，其特征在于，所述抗核抗体靶抗原为权利要求1至6中任一项所述的抗核抗体靶抗原偶联物试剂。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述抗核抗体靶抗原偶联物试剂的浓度为0.5～2mg/mL；优选地，所述试剂盒还包括校准品、质控品、发光标记物标记的抗人免疫球蛋白抗体、试剂缓冲液以及样本稀释液中的任意一种或多种；更优选地，所述发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、异鲁米诺衍生物、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，所述抗人免疫球蛋白抗体为抗人IgA、抗人IgM、抗人IgG、抗人LgD或抗人LgE中的一种或多种；更优选地，所述试剂缓冲液为Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液；更优选地，所述样本稀释液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或生理盐水。9.一种抗核抗体靶抗原偶联物试剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将细胞提取物靶抗原与第一部分磁性微球进行偶联，形成包被所述第一部分磁性微球的第一偶联物；将纯化靶抗原与第二部分磁性微球进行偶联，形成包被所述第二部分磁性微球的第二偶联物。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述细胞提取物靶抗原与所述第一部分...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶微，张云，袁锦云，孙志成，李婷华，罗凯，
申请(专利权)人：深圳市新产业生物医学工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44