一种抗药抗体的检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种抗药抗体的检测方法及检测试剂盒，其方法包括待测样品预处理和预处理样品检测，采用高密度富集磁珠对待测样品进行富集后对样品进行磁微粒化学发光免疫检测。通过高密度富集磁珠进行预处理，可以实现对样品中包括以药物‑ADA复合体形式存在的总ADA进行检测，得以克服样品中高浓度药物蛋白的影响，提高ADA检测方法的耐药性，同时也具有化学发光免疫检测方法的快速、自动化分析的优点。试剂盒包括高密度富集磁珠试剂、检测用磁珠试剂、标记发光基团的药物、样品稀释液、酸化液、中和液、质控品和激发液，采用试剂盒可以快速、准确检测抗药抗体。

Detection method and detection kit for anti drug antibody

The present invention discloses a detection method and a detection kit for anti drug antibody. The method includes preprocessing of samples to be measured and pretreated sample detection, and high density enrichment magnetic beads are used to enrich the samples after enrichment. Through the pretreatment of high density enriched magnetic beads, the total ADA in the form of drug ADA complex can be detected, the effect of high concentration drug protein in the sample is overcome, the drug resistance of the ADA detection method is improved, and the rapid and automatic analysis of the chemiluminescence immunoassay method is also carried out. The advantage of it. The kit includes high density enrichment magnetic bead reagent, magnetic bead reagent, drug marking luminescent group, sample diluent, acidification liquid, neutralization solution, quality control product and excitation liquid. The anti drug antibody can be quickly and accurately detected by the kit.

【技术实现步骤摘要】
一种抗药抗体的检测方法及检测试剂盒
本专利技术涉及磁微粒化学发光免疫诊断领域，特别是涉及一种抗药抗体的检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
自1982年首个重组蛋白类药物批准上市以来，目前国内外共有260多种治疗性重组蛋白类药物(包括70多种治疗性单抗药物)在临床上得到了广泛应用，用于230多种适应证的治疗(NatBiotechnol,2014.32(10):p.992-1000；HealthAff(Millwood),2015.34(2):p.210-9)。随着对治疗性重组蛋白药物的研究越来越深入，对相关药物给药过程中产生的抗体即抗药抗体(Anti-DrugAntibody，ADA)的研究越来越受到重视(ImmunolToday,1986.7(12):p.367-8.；FrontImmunol,2016.7:p.21.)。抗药抗体的产生，会对治疗性重组蛋白类药物的安全性和有效性带来影响，因此ADA的检测是临床用药过程中需要密切关注的指标。此外，由于治疗性重组蛋白类药物的制剂形式和成分等会对蛋白质的免疫原性产生影响，因此，在药物开发过程中(包括临床前研究和临床试验阶段)，对ADA进行检测和评价已经成为药品监管部门的常规要求(FDA,GuidanceforIndustry:ImmunogenicityAssessmentforTherapeuticProteinProducts.2014.)。重组蛋白类药物，由于与内源性蛋白氨基酸序列的差异、蛋白结构的改变及修饰、药物剂型、药物聚合、给药间隔和给药途径等因素，均可导致抗药抗体的产生；进而使药效下降甚至丧失、药物毒性增加、过敏反应与超敏反应发生、与内源蛋白产生交叉反应等，这些均造成潜在的药效损失和安全隐患。临床证据表明，患者体内抗药抗体的浓度在低至100ng/mL的水平时，就会具有临床意义上的影响，比如改变药代/药动、带来药物安全性隐患和降低药物治疗效果(AAPSJ,2013.15(1):p.30-40.)。因此在ADA浓度达到100ng/mL前，就需要对患者体内的ADA进行有效测定，以供临床决策参考。ADA在样品中会有两种存在形式，即游离ADA和ADA-药物结合复合物。此外，快速解离抗药抗体(如IgM)是免疫反应早期出现的抗体，各种ADA检测方法均需要评价对此类抗体的检测效果。如果不能检测到快速解离抗药抗体(如IgM)，则会低估真实阳性样品中的抗药抗体水平(FDA,GuidanceforIndustry:AssayDevelopmentandValidationforImmunogenicityTestingofTherapeuticProteinProducts.2016)。常规的桥接ELISA法通常只能检测血浆中的游离ADA。为了检测与药物结合的ADA，通常需要进行样品的前处理，采用包括酸化处理或高温孵育等的方法释放ADA。随着单抗类重组蛋白药物种类的增加，临床上日益凸显的一个挑战是，高给药浓度条件下(血药浓度可达0.1～1mg/mL)，药物蛋白干扰ADA检测。因此，评价ADA测定方法的耐药性(assay’sdrugtolerance)也成为了临床药品监管部门对药物研发和上市后监管的要求(FDA,GuidanceforIndustry:AssayDevelopmentandValidationforImmunogenicityTestingofTherapeuticProteinProducts.2016)。ADA测定方法的耐药性评价可以为蛋白类药物的剂量临床试验提供最优采样时间点的确定依据(USPGeneralChapter1106ImmunogenicityAssays–DesignandValidationofImmunoassaystoDetectAnti-DrugAntibodies.)。高浓度药物蛋白对ADA检测的干扰是目前ADA检测技术的巨大障碍，常规的处理方法包括亲和分离，以及利用加入高浓度药物蛋白(1mg/mL)对ADA进行饱和结合进而采用聚乙二醇PEG(polyethyleneglycol)沉淀ADA-药物复合体，而后酸解并包被于多孔板，再通过加酶标药物进行ADA的检测(AAPSJ,2017.19(2):p.468-474.)。目前，对于ADA的检测方法已有报道，常用ELISA桥接检测法，其主要步骤为：微孔板包被2.0μg/mL药物，每孔100μL，4℃静置过夜；BSA封闭后，按顺序加入0.5μg/mL生物素偶联药物、Tris(pH9.6)和酸处理标准曲线、质控品及待测样品[3μL样品加入100μL300mM醋酸溶液，混匀，室温孵育(1.5±0.5)h]，在室温振板温育2-2.5h；洗板后，每孔加入稀释后的SA-HRP(偶联链霉亲和素的辣根过氧化物酶)100μL，室温温育0.5-1h；洗板后，每孔加入100μL底物(TMB)，室温避光反应18-22min，最后以1MH2SO4终止反应，加入每孔50μL，在450nm处(参比波长630nm)测定OD值(JPharmBiomedAnal,2005.39(3-4):p.364-75.；中国药学杂志,2017.52(1):p.14-19.)。现有ELISA方法存在不足之处是：只能进行低浓度药物(甚至样品中的药物不可检出)情况下的游离ADA检测，即不能克服高浓度药物蛋白对ADA检测的干扰，也不能检出与药物结合形成复合物的ADA；在检测过程中的洗涤步骤容易洗脱快速解离抗药抗体，从而造成ADA的低估；ELISA方法多采用辣根过氧化物酶进行检测，其检测范围和灵敏度都较低；ELISA方法的检测时间通常反应是一件较长，完成一个测试所倡的总时间一般在2个小时以上，无法满足临床上的快速诊断的需求；ELISA方法不能随机进样检测，检测结果存在滞后性。中国专利申请CN105424682A提供一种Anti-Bevacizumab抗药抗体检测试剂盒，包括生物素化Bevacizumab、抗Bevacizumab抗体校准品、抗Bevacizumab抗体质控品、AP-抗ADA抗体、磁微粒试剂和清洗液，所述生物素化Bevacizumab为偶联有生物素的Bevacizumab，所述AP-抗ADA抗体为碱性磷酸酶(AP)标记的抗ADA抗体，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。中国专利申请CN105467114A提供一种抗药抗体Anti-Trastuzumab检测试剂盒，包括生物素化Trastuzumab、抗Trastuzumab抗体校准品、抗Trastuzumab抗体质控品、AP-抗ADA抗体、磁微粒试剂、化学发光底物和清洗液，所述生物素化Trastuzumab为偶联有生物素的Trastuzumab，所述AP-抗ADA抗体为AP标记的抗ADA抗体，所述磁微粒试剂为表面有亲和素的纳米磁微粒悬浮液。该检测试剂盒基于磁微粒化学发光检测原理来实现ADA的免疫检测，与ELISA方法相比其检测速度快，灵敏度高，但仍无法克服高浓度药物蛋白对ADA检测的干扰。CN105424682A和CN105467114A所描述的方法在原理上与ELISA桥接检测法相同，只是把固相包被的介质由多孔板变为磁微粒，同时把酶促化学反应的底物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗药抗体的检测方法，其特征是包括以下步骤：S1 待测样品预处理；S2 预处理样品检测；所述步骤S1中采用高密度富集磁珠对待测样品进行富集，高密度富集磁珠是由蛋白类药物分子通过化学偶联方法结合到平均粒径为0.2‑2μm的氨基磁珠表面得到的；所述步骤S2对预处理后的样品进行磁微粒化学发光免疫检测。

【技术特征摘要】
1.一种抗药抗体的检测方法，其特征是包括以下步骤：S1待测样品预处理；S2预处理样品检测；所述步骤S1中采用高密度富集磁珠对待测样品进行富集，高密度富集磁珠是由蛋白类药物分子通过化学偶联方法结合到平均粒径为0.2-2μm的氨基磁珠表面得到的；所述步骤S2对预处理后的样品进行磁微粒化学发光免疫检测。2.根据权利要求1所述的抗药抗体的检测方法，其特征是所述步骤S2中检测用磁珠为蛋白类药物分子通过化学偶联方法结合到平均粒径为1μm-5μm氨基磁珠表面所得到的。3.根据权利要求1所述的抗药抗体的检测方法，其特征是所述步骤S2中用于与蛋白类药物分子结合的化学发光物分子为：N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。4.一种抗药抗体的检测试剂盒，其特征是所述试剂盒包括高密度富集磁珠试剂、检测用磁珠试剂、标记发光基团的药物、样品稀释液、酸化液、中和液、质控品和激发液。5.根据权利要求4所述抗药抗体的检测试剂盒，其特征是所述高密度富集磁珠试剂为蛋白类药物分子通过化学偶联方法结合到平均粒径为0.2-2μm的氨基磁珠表面得到的高密度富集磁珠，加入BSA溶液得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾向阳，刘海涌，陈健平，贾鹏飞，贾鹏耀，
申请(专利权)人：北京新艾进生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11