猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用。所述的双价疫苗中，其有效成分由猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽组成，其中，所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。实验证明，本发明专利技术的双价疫苗经过加强免疫后能够诱导机体产生高水平的针对O型和A型口蹄疫病毒的中和抗体，保护免疫猪能够抵抗O型和A型口蹄疫强毒攻击，均5/5保护，即保护率为100％。本发明专利技术的提出为保障我国畜牧业健康可持续发展，实现口蹄疫国家中长期防控目标提供了技术支撑和疫苗储备。

Swine Foot and mouth disease virus type O and A Fc peptide bivalent vaccine and preparation method and application thereof

The invention discloses a Swine Foot and mouth disease virus type O and A type Fc polypeptide bivalent vaccine and a preparation method and application thereof. In the bivalent vaccine, the effective component is composed of the A type Fc polypeptide of the pig foot-and-mouth disease virus and the O type Fc polypeptide of the pig foot-and-mouth disease virus, in which the amino acid sequence of the A Fc polypeptide of the pig foot-and-mouth disease virus A is shown as SEQ ID NO.3, and the amino acid sequence of the O Fc polypeptide of the pig FMD virus is shown as SEQ. The experiment proved that the bivalent vaccine can induce high level of neutralization antibody against O and A type FMDV after enhanced immunization, and protect immune pigs against O and A type of FMD, 5/5 protection, that is, the protection rate is 100%. The invention provides technical support and vaccine reserves for ensuring the healthy and sustainable development of China's livestock industry and achieving the goal of medium and long term prevention and control of foot-and-mouth disease in the country.

【技术实现步骤摘要】
猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种猪口蹄疫疫苗及其制备方法和应用，特别涉及一种猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用，本专利技术属于医药

技术介绍
口蹄疫作为重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康发展，而且涉及动物源性食品安全以及其外贸出口。一旦发生疫情损失惨重，影响恶劣。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的传染病，我国将其列为一类动物传染病。为了净化和消灭口蹄疫，我国制定了《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》和《国家口蹄疫防控计划(2016-2020)》，把FMD被列为优先解决的动物疫病之一。要实现此目标，必须要有安全、高效、可鉴别诊断的疫苗，而灭活疫苗始终存在病毒逃逸的生物安全隐患，多次免疫后难以区分免疫动物和感染动物，不利于口蹄疫净化，也不利于我国活畜及产品出口。因此，采用分子生物学技术研制安全、高效的FMD基因工程新型疫苗是实现国家口蹄疫防治规划的技术保障和物质基础，也是提高我国口蹄疫防控能力，保障我国畜牧业健康可持续发展，推动农业产业结构调整，促进农民增收，提高活畜及产品的出口能力，提升我国的政治声誉等的重要途径，符合国家兴农富国的战略需求。近年来，我国口蹄疫流行态势也发生了变化，由单一血清型(O型)发展为多个血清型(O、Asia1和A型)并存的复杂局面。尽管经过几年的强制免疫，Asia1连续一年以上没有出现新的病例，农业部宣布Asia1退出强制免疫。但作为素有FMDV“放大器”之称的猪，从过去仅感染O型FMD发展到既感染O型FMD也感染A型FMD。更为严重的是，O型出现了三个拓扑型，A型2个拓扑型均为传入性的，拓扑型间抗原变异较大，意味着要针对不同拓扑型的毒株研制新的灭活疫苗。因此，通过经典方法研制口蹄疫灭活疫苗已经不能满足新形势下口蹄疫防控的要求。利用新技术快速研制安全高效的口蹄疫新型疫苗迫在眉睫，不仅可以大大缩短疫苗研制的周期，快速投放市场用于紧急防控，而且可以根据疫情需要，做到“料敌先机”，提前研制疫苗做到精准防控，防止新毒株传入我国。此外，新疫苗的研究还将引领动物疫苗研发新方向，建立新的
，促进动物疫苗的升级换代，带动新型疫苗生产企业快速发展，形成新的经济增长点。为保障我国畜牧业健康可持续发展，实现口蹄疫国家中长期防控目标提供技术支撑和疫苗储备。利用反向疫苗学技术研制口蹄疫表位疫苗已成为可能，本实验室已经利用该技术研制出了多种口蹄疫表位疫苗均具有较好的免疫效果。为了进一步提升表位疫苗的免疫效果，减小与灭活疫苗的差距。本研究对表位进行了重新的设计和/或改进，改进了表位抗原的展示方式。尤其是充分利用了宿主动物免疫球蛋白(IgG)Fc能与免疫细胞表面的Fc受体结合或补体受体的细胞结合，激发免疫细胞产生免疫效应的免疫学功能，提升表位疫苗的免疫效果。如Fc能与许多细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、中性粒了细胞和血小板等)表面Fc受体结合，发挥调理作用，增强巨噬细胞的吞噬作用；其次，Fc与细胞表面Fc受体结合后能够活化细胞，发挥细胞毒作用。基于IgG的Fc具有良好的免疫学功效，本专利技术以猪IgG的Fc为骨架，结合我国猪口蹄疫流行现状和防控需求，利用反向疫苗学、生物信息学和生物化学结等多种技术筛选、设计猪口蹄疫A型、O型不同拓扑型毒株的表位抗原基因，利用免疫球蛋白Fc基因功能区展示抗原表位，研制猪口蹄疫A型、O型Fc多肽双价疫苗。为了充分发挥表位抗原和Fc的免疫学功能，最大程度确保融合蛋白的天然形式，本专利技术还通过筛选原核表达系统，优化表达条件，确保融合蛋白以可溶性形势表达。将纯化的O型和A型多表位Fc融合蛋白按照相应比例混合后与MontanideISA206佐剂配伍制备疫苗，采用加强免疫方式免疫猪，通过特异性抗体效价和攻毒保护实验评价疫苗对猪的免疫效力。结果显示，经过重新设计抗原表位，筛选表达系统，优化表达条件，实现了Fc展示抗原表位重组蛋白的可溶性表达，最大程度展示了抗原表位。实验证明，本专利技术的二价疫苗经过加强免疫后能够诱导机体产生高水平的针对O型和A型口蹄疫病毒的中和抗体，保护免疫猪能够抵抗O型和A型口蹄疫强毒攻击，均5/5保护，即保护率为100％。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗，所述疫苗的有效成分由猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽组成，其中，所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术所述的疫苗中，优选的，猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的质量比为2：1。在本专利技术所述的疫苗中，优选的，还包含佐剂。进一步的，本专利技术还提出了一种制备所述的猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗的方法，包括以下步骤：(1)获得编码猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列；(2)将获得的编码猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列分别插入原核表达载体pET-28a(+)中构建重组表达质粒，转化大肠杆菌感受态进行阳性筛选，得到阳性重组表达质粒，命名为pMEO-Fc和pMEA-Fc，-20℃保存备用；(3)将步骤(2)得到的阳性重组表达质粒pMEO-Fc和pMEA-Fc分别转化大肠杆菌感受态，从LAB平板挑单克隆接种含卡那霉素的无菌LB培养液，于37℃培养箱220rmp过夜培养，将过夜培养物加入新制备的含卡那霉素的无菌LB培养液中，于30℃培养箱220rmp培养至OD600为0.4～0.6时，于超净台无菌条件下加入0.4mM的IPTG于30℃220rmp诱导表达4～6小时，离心收获培养物；(4)分别向pMEO-Fc和pMEA-Fc的原培养物中加入蛋白裂解液，冰浴条件下进行超声破碎处理，离心收集上清，弃沉淀；(5)从收集的上清中获得纯化后的蛋白，即猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽；(6)将纯化后的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽混合后，加入油佐剂乳化成疫苗制剂。其中，优选的，编码猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列分别如SEQIDNO.2以及SEQIDNO.4所示。其中，优选的，将猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽按照2:1(w/w)混合后，与油佐剂MontanideISA206按照1:1(w/w)乳化成疫苗制剂(W/O/W)，每头份1ml，其中含猪口蹄疫病毒O型Fc多肽100μg，猪口蹄疫病毒A型Fc多肽200μg。其中，优选的，步骤(5)中使用Ni-NTA组氨酸纯化柱进行蛋白的纯化。更进一步的，本专利技术还提出了所述的疫苗在制备预防猪口蹄疫病毒O型以及A型药物中的应用。相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术以猪IgG的Fc为骨架，结合我国猪A型口蹄疫流行现状和防控需求，利用反向疫苗学、生物信息学和生物化学结等多种技术筛选、设计猪口蹄疫A型不同拓扑型毒株的表位抗原基因，利用免本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗，其特征在于，所述疫苗的有效成分由猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽组成，其中，所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗，其特征在于，所述疫苗的有效成分由猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽组成，其中，所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述的猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。2.如权利要求1所述的猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗，其特征在于，所述的猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的质量比为2：1。3.如权利要求1所述的猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗，其特征在于，所述的疫苗中还包含佐剂。4.一种制备权利要求1所述的猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)获得编码猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列；(2)将获得的编码猪口蹄疫病毒A型Fc多肽以及猪口蹄疫病毒O型Fc多肽的核苷酸序列分别插入原核表达载体pET-28a中构建重组表达质粒，转化大肠杆菌感受态进行阳性筛选，得到阳性重组表达质粒，命名为pMEO-Fc和pMEA-Fc，-20℃保存备用；(3)将步骤(2)得到的阳性重组表达质粒pMEO-Fc和pMEA-Fc分别转化大肠杆菌感受态，从LAB平板挑单克隆接种含卡那霉素的无菌LB培养液，于37℃培养箱220rmp过夜培养，将过夜培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：常惠芸，邵军军，李杨帆，张永光，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62