犬细小病毒疫苗组合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种犬细小病毒疫苗组合物注射制剂和口服制剂，其包含以下a)和b)、基本上由以下a)和b)组成、或者由以下a)和b)组成：a)、由马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的犬细小病毒VP2蛋白自组装形成的类病毒颗粒；b)、药学上或兽医学上可接受的用于注射/口服制剂的辅料。本发明专利技术还公开了上述疫苗组合物的制备方法和应用。本发明专利技术提供的犬细小病毒类病毒颗粒疫苗免疫可获得高水平血清IgG抗体，具有良好的免疫原性，能够减少和预防犬细小病毒感染所引起相关性疾病，并具有安全性高、生产成本低并可放大规模生产、操作简单等优点，可应用于预防和减少CPV感染所引起相关性临床症状。

Canine parvovirus vaccine composition, preparation method and application thereof

The present invention discloses a canine parvovirus vaccine composition injection and oral preparation, comprising the following a and b), basically by the following a and b), or by the following a and b): a), the self assembled virus like particles of the canine parvovirus VP2 protein expressed by recombinant engineered strains of Marx crevier yeast; b), and the drug Acceptable adjunct for injection / oral preparation in school or veterinary science. The invention also discloses the preparation method and application of the vaccine composition. The canine parvovirus particle vaccine provides high level serum IgG antibody, has good immunogenicity, can reduce and prevent the related diseases caused by canine parvovirus infection, and has the advantages of high safety, low production cost, large scale production, simple operation and so on. Prevent and reduce the clinical symptoms associated with CPV infection.

【技术实现步骤摘要】
犬细小病毒疫苗组合物及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物技术和兽医领域，具体涉及犬细小病毒疫苗组合物及其制备方法与应用。
技术介绍
犬细小病毒病是一种急性高度接触性传染性疾病，可引起成年犬出血性肠胃炎及小狗的心肌炎，该病症于1977年由Eugster发现。犬细小病毒病由犬细小病毒(CanineParvovirus,CPV)引起，该病毒主要引起病犬呕吐、出血性腹泻，并伴有白细胞大量减少等病征。该病一年四季均可发生，具有发病急、病程短、传染性强、死亡率高等特点。不同品种、不同年龄的犬均易感，幼犬易感性高，发病率为50％-100％，死亡率为10％-50％。该病严重影响家养宠物的健康，同时对养犬业造成了巨大的经济损失，是犬的烈性传染病之一。1978年美国实验室首次从患肠炎犬的粪便中分离得到一株犬细小病毒。为了与犬微小病毒(MVC即CPV-1)相区别，将其命名为CPV-2。通过序列分析发现，该病毒与猫细小病毒(FPV)有很近的亲缘性。遗传进化分析显示，所有的CPV突变株均来源于十九世纪七十年代出现的一个病毒，该病毒与FPV有很近的亲缘性。在十九世纪八十年代，应用单克隆抗体技术检测出CPV-2的两株突变株CPV-2a和CPV-2b。现在，CPV的抗原变异株己经完全取代了CPV-2，大量的分布于世界各地的犬群中。现在，犬细小病毒已经成为研究病毒进化的重要模型，最近在检测CPV-2时常常出现，但不引起抗原性的改变，他们被称为“新CPV-2a”和“新CPV-2b”。最近，新的CPV变异株接连出现，1997年在越南豹中分离到的CPV-2c(a)和CPV-2c(b)，这两株病毒是在自然条件下，由新CPV-2a和新CPV-2b中VP2的300Gly→Asp得到的。CPV-2c(a)已经从韩国的犬中分离得到，暗示了此病毒已经在家养犬中传播开来。2000年，一株新CPV-2b变异株在意大利的南部被发现，它是由VP2基因的426Asp→Glu形成的，2002年，相似的病毒在越南犬中也分离得到，并用做单克隆抗体的研究，检测到它是一株CPV的抗原变异株。接下来，通过Nakamura等人研制的单克隆抗体21C3确定，意大利的426Glu与越南分离株相比有相似的抗原性，欧洲将其称为CPV-2c。随着CPV不断进化，目前己经存在多个亚型。尽管传统的减毒CPV疫苗一直非常成功地减少了疾病暴发的数量，当前临床上使用的弱毒疫苗与灭活疫苗在免疫效果上已有所下降，同时随着人们的认识不断加深，传统疫苗的局限性也日益显露出来，例如:①容易受母源抗体影响，导致免疫失败；②疫苗在生产过程中有可能没有被完全杀死或者充分致弱，从而危害动物健康：③弱毒株可能发生突变、毒力返强现象。这些都给预防该病带来了困难，因此基因工程疫苗逐渐成为疫苗研究的热点，目前，国内外学者已经在基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗和重组活载体疫苗等方面对犬细小病毒的新型疫苗进行了尝试。CPV基因主要编码4种蛋白(VP1，VP2，NS1，NS2)，其中VP1和VP2为结构蛋白，NS1和NS2为非结构蛋白。病毒空衣壳中只含有VP1和VP2两种蛋白，VP2是构成衣壳蛋白的主要成分，位于VP1的C端，VP1蛋白的C端氨基酸和VP2蛋白的N端氨基酸序列相互重叠，且二者终止于同一密码子。研究较多的主要是VP2结构蛋白，CPV的中和抗原位点位于VP2上，VP2蛋白是CPV的免疫原性蛋白，编码CPV的主要抗原决定簇，可诱导机体产生中和抗体。VP2基因的N端以及该基因上的蛋白转角结构区loop1和loop3是重要的B细胞抗原表位区，可诱导机体产生中和抗体。VP2基因全长1755nt，编码584个氨基酸，VP2上的几个关键碱基和氨基酸的变化就会改变抗原特性和宿主范围。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术提供了一种免疫效果好、生产成本低、工艺简单以及更安全的新型犬细小病毒疫苗，并提供了其制备方法与应用。其具体技术方案如下：本专利技术在第一方面提供了一种犬细小病毒疫苗组合物，其包含以下a)和b)、基本上由以下a)和b)组成、或者由以下a)和b)组成：a)、由马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的犬细小病毒VP2蛋白自组装形成的类病毒颗粒；b)、药学上或兽医学上可接受的用于注射制剂的辅料；其中，上述马克斯克鲁维酵母重组工程菌是由编码上述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列插入马克斯克鲁维酵母表达载体所构成的重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株构建得到；上述重组表达载体编码上述犬细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术在第二方面提供了另一种犬细小病毒疫苗组合物，其包含以下a)和c)、基本上由以下a)和c)组成、或者由以下a)和c)组成：a)、由马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的犬细小病毒VP2蛋白自组装形成的类病毒颗粒；c)、药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料；其中，上述马克斯克鲁维酵母重组工程菌是由编码上述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列插入马克斯克鲁维酵母表达载体所构成的重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株构建得到；上述重组表达载体编码上述犬细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。优选地，上述重组表达载体包括马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、编码上述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列，且不含有无抗性基因序列及大肠杆菌起始复制序列。更优选地，上述重组表达载体还包括马克斯克鲁维酵母自主复制序列、营养缺陷筛选标记基因序列和克鲁维酵母起始复制序列。优选地，上述马克斯克鲁维酵母表达载体包含如SEQIDNo.5所示的核苷酸序列。优选地，上述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株为马克斯克鲁维酵母菌敲除部分或全部特定营养基因所得。更优选地，上述特定营养基因为URA3基因。在较优实施例中，上述马克斯克鲁维酵母菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10621(保藏单位代码：CGMCC，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年3月13日，检测结果：存活，分类命名：马克斯克鲁维酵母Kluyveromycesmarxianus)。优选地，编码上述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列，包括1)、如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或2)、编码取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有犬细小病毒VP2蛋白活性的氨基酸、且由SEQIDNo.1所衍生的核苷酸序列。优选地，上述药学上或兽医学上可接受的用于注射制剂的辅料至少包括佐剂。更优选地，上述佐剂选自水包油、油包水、水包油包水佐剂中的任意一种或几种。优选地，上述药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料至少包括淀粉。本专利技术在第三方面提供了上述犬细小病毒疫苗组合物注射制剂的制备方法，包括以下步骤：步骤1、将编码犬细小病毒VP2蛋白的核苷酸插入到马克斯克鲁维酵母表达载体中，构建重组表达载体；步骤2、用上述重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株，构建马克斯克鲁维酵母重组工程菌株；步骤3、使上述马克斯克鲁维酵母重组工程菌株发酵表达上述犬细小病毒VP2蛋白，上述犬细小病毒VP2蛋白在酵母细胞内自组装成猪细小病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述犬细小病毒疫苗组合物包含以下a)和b)、基本上由以下a)和b)组成、或者由以下a)和b)组成：a)、由马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的犬细小病毒VP2蛋白自组装形成的类病毒颗粒；b)、药学上或兽医学上可接受的用于注射制剂的辅料；其中，所述马克斯克鲁维酵母重组工程菌是由编码所述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列插入马克斯克鲁维酵母表达载体所构成的重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株构建得到；所述重组表达载体编码所述犬细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述犬细小病毒疫苗组合物包含以下a)和b)、基本上由以下a)和b)组成、或者由以下a)和b)组成：a)、由马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的犬细小病毒VP2蛋白自组装形成的类病毒颗粒；b)、药学上或兽医学上可接受的用于注射制剂的辅料；其中，所述马克斯克鲁维酵母重组工程菌是由编码所述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列插入马克斯克鲁维酵母表达载体所构成的重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株构建得到；所述重组表达载体编码所述犬细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.一种犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述犬细小病毒疫苗组合物包含以下a)和c)、基本上由以下a)和c)组成、或者由以下a)和c)组成：a)、由马克斯克鲁维酵母重组工程菌表达的犬细小病毒VP2蛋白自组装形成的类病毒颗粒；c)、药学上或兽医学上可接受的用于口服制剂的辅料；其中，所述马克斯克鲁维酵母重组工程菌是由编码所述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列插入马克斯克鲁维酵母表达载体所构成的重组表达载体转化马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株构建得到；所述重组表达载体编码所述犬细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。3.根据权利要求1或2所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述重组表达载体包括马克斯克鲁维酵母菊粉酶启动子基因序列、编码所述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列、马克斯克鲁维酵母菊粉酶终止子基因序列，且不含有无抗性基因序列及大肠杆菌起始复制序列。4.根据权利要求1或2所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述重组表达载体还包括马克斯克鲁维酵母自主复制序列、营养缺陷筛选标记基因序列和克鲁维酵母起始复制序列。5.根据权利要求1或2所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母表达载体包含如SEQIDNo.5所示的核苷酸序列。6.根据权利要求1或2所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母营养缺陷型菌株为马克斯克鲁维酵母菌敲除部分或全部特定营养基因所得。7.根据权利要求6所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述特定营养基因为URA3基因。8.根据权利要求6所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10621。9.根据权利要求1或2所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，编码所述犬细小病毒VP2蛋白的基因序列，包括1)、如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或2)、编码取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有犬细小病毒VP2蛋白活性的氨基酸、且由SEQIDNo.1所衍生的核苷酸序列。10.根据权利要求1所述的犬细小病毒疫苗组合物，其特征在于，所述药学上或兽医学上可接受的用于注射制剂的辅料至少包括佐剂。11.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕红，陈蕾，周峻岗，余垚，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31