一种石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种石斑鱼虹彩病毒的疫苗及其制备方法和应用。本发明专利技术的石斑鱼虹彩病毒的疫苗是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的蛋白。其是构建质粒pET32a‑VP88并转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达并破碎细胞后自上清中回收重组蛋白，即为石斑鱼虹彩病毒的疫苗。可以将重组蛋白rVP88与佐剂混合，所得疫苗混合液具有对新加坡石斑鱼虹彩病毒SGIV免疫保护的作用。本发明专利技术的石斑鱼虹彩病毒的疫苗其免疫效果稳定，保护率较高，具有高效保护性，可应用石斑鱼养殖过程中保护鱼苗及成鱼对抗石斑鱼虹彩病毒感染。

Recombinant envelope protein vaccine of Epinephelus iridus iridus and its application

The invention discloses a vaccine for Epinephelus iridus and its preparation method and application. The vaccine for Epinephelus iridus is the protein encoded by nucleotide sequence shown in SEQ ID NO.1. It is the construction of plasmid pET32a VP88 and the transformation of Escherichia coli BL21 (DE3) to induce and break the cells to recover the recombinant protein from the supernatant, that is, the vaccine of the iridiridic virus of the grouper. The recombinant protein rVP88 can be mixed with adjuvants, and the vaccine mixture has the protective effect against the SGIV of the grouper iridescent virus. The vaccine of the spotted fish iridvirus has a stable immune effect, high protection rate and high efficiency, and can protect the fish and adult fish against the iridescent virus infection of the grouper in the process of aquaculture.

【技术实现步骤摘要】
一种石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗及其应用
：本专利技术属于分子生物学及免疫学领域，具体涉及到一种具有免疫保护性的新加坡石斑鱼虹彩病毒重组囊膜蛋白疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
：石斑鱼是一种经济价值高的海洋鱼类。近年来沿海石斑鱼养殖规模扩大,但养殖环境日益恶化，各种病害特别是病毒性疾病频繁爆发，造成了重大的经济损失。虹彩病毒是石斑鱼的重要致病病原，它可以造成鱼类的死亡率从30％(成鱼中)到100％(幼苗阶段)。这种病毒在亚洲，特别是在25℃以上的高水温时，极易感染东亚和南亚等区域养殖的海水名贵鱼类，如石斑鱼、尖吻鲈、真鲷、牙鲆和大黄鱼等，致使鱼类大量死亡，造成严重经济损失。新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singaporegrouperiridovirus，SGIV)是从养殖的石斑鱼中分离到的一株新的虹彩病毒，可导致石斑鱼幼苗死亡率达90％以上，给石斑鱼的养殖带来巨大的经济损失。因此，如何防治虹彩病毒病已成为当今石斑鱼养殖业急需解决的重要问题。众所周知，疫苗作为化学药品和抗生素的替代品，是治疗疾病、特别是病毒病的最好选择。疫苗接种是防治病毒曼延的有效手段，包括灭活疫苗、DNA核酸疫苗、减毒疫苗和重组蛋白亚单位疫苗等。针对石斑鱼虹彩病毒SGIV，已经开发出全病毒灭活疫苗、DNA核酸疫苗。制备全病毒灭活疫苗需要进行细胞培养、病毒扩增，对细胞培养技术、设备使用及培养基、材料如血清等消耗要求较高；由于在制备全病毒灭活疫苗过程中可能存在病毒抗原丢失、抗原结构被破坏而造成免疫效果不稳定。DNA核酸疫苗虽然制备比较简单，且可产生持久免疫应答，但核酸DNA可能诱导产生自身免疫反应，持续表达外源抗原，可能导致机体对该抗原产生免疫耐受。重组蛋白疫苗绝对不含活毒成分，生产和使用过程无散毒可能，消除了污染的可能性，且免疫特异性强、重复性较好，可以通过发酵大规模生产，成本较低，是值得积极推广使用的安全疫苗。随着分子生物学技术的发展，对病毒基因结构与功能的研究深入，研制基因工程重组蛋白疫苗日趋成熟，是国内外发展的主要方向，已经广泛应用于多种人和动物疫苗的生产。囊膜蛋白是具囊膜的虹彩病毒的重要表面抗原，目前没有针对新加坡石斑鱼虹彩病毒SGIV的重组囊膜蛋白疫苗报道。因此，研发该病毒的重组囊膜蛋白疫苗产品，能够在低成本条件下大规模生产应用，快速、安全、有效预防控制该病毒的传播，从而保障石斑鱼养殖业的健康发展。
技术实现思路
：本专利技术的第一个目的是提供一种疫苗稳定，保护率高的石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗。本专利技术的石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗，其特征在于，所述的石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗是SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码的多肽。进一步优选，所述的SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码的多肽与佐剂氢氧化铝混合形成石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗。本专利技术的第二个目的是提供一种石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，将SEQIDNO.1所示的核苷酸序列转入到表达载体中，再将此表达载体转入宿主菌中，表达SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码的多肽，然后纯化收集此多肽，即得石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗。优选，所述的表达载体为质粒pET-32a。优选，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。进一步优先，所述的石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗是通过以下方法制备的：1)质粒pET-32a-VP88的构建：将质粒pET-32a用EcoRI/SalI酶切，回收5.9kb片段；以新加坡石斑鱼虹彩病毒SGIV基因组DNA为模板，用引物VP88-F和VP88-R进行PCR扩增，产物纯化后用EcoRI/SalI酶切，回收1.5kb片段，将其与上述5.9kb片段连接，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，并筛选转化子提取质粒，即为质粒pET32a-VP88；所述引物VP88-F为5’-GCGAATTCATGGGCGCAGCGCAATC-3’，引物VP88-R为5’-GCGTCGACTCACTTTGCAGCTTCTC-3’；2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将质粒pET-32a-VP88转化大肠杆菌BL21(DE3)，得转化子BL21/pET32a-VP88；将BL21/pET32a-VP88于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养；取过夜后的培养液加入LB液体培养基中，于37℃培养至OD600为0.6，加入终浓度为0.8mM的IPTG并于16℃继续培养6h，然后在离心后菌液中加入PBS缓冲液，采用超声波破碎菌体1-2小时，将菌体破碎液离心，回收上清；将上清液采用His·Tag树脂亲合层析纯化方法纯化,即得SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码的多肽，即为石斑鱼虹彩病毒的重组蛋白疫苗。进一步优先，所述的步骤2)中的将菌体破碎液离心，回收上清，将上清液10倍体积与1倍体积His·Tag树脂结合，装载到层析柱，然后用15倍体积的结合缓冲液冲洗层析柱中结合了重组蛋白的His·Tag树脂，洗去杂蛋白，然后用10倍体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液，即得SEQIDNO.1核苷酸序列编码的多肽，即为石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗。本专利技术的第三个目的是提供SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码的多肽在制备石斑鱼彩虹病毒的疫苗中的应用。所述的石斑鱼彩虹病毒的疫苗为新加坡石斑鱼彩虹病毒的疫苗。本专利技术的免疫保护性重组蛋白rVP88(SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码的多肽)，或重组蛋白rVP88与氢氧化铝佐剂混合，所得为疫苗混合液，具有对新加坡石斑鱼虹彩病毒SGIV免疫保护的作用。将所述疫苗注射于石斑鱼的体内，30天后，注射SGIV病毒，观察、统计石斑鱼死亡率，并计算疫苗的相对保护率。结果表明，rVP88的相对保护率为38.46％，rVP88蛋白与氢氧化铝佐剂混合配伍后的相对保护率达到50％。所述每毫升疫苗或疫苗混合液中含免疫保护性重组蛋白(免疫保护性重组蛋白rVP88)200μg；所述注射石斑鱼体内的重组蛋白疫苗或疫苗混合液为100μl。本专利技术具有如下优点：1.所述的BL21/pET-VP88重组菌可规模发酵培养，发酵菌体生物量可达湿重20g/L以上，经过细胞破碎、纯化，得到rVP88重组蛋白约200mg/L，纯度90％以上。所述生产疫苗简单方便、成本较低，产品安全，无毒、无污染、无扩散，且方便保存。2.所述重组蛋白疫苗稳定，保护率较高。本专利技术的重组蛋白疫苗对石斑鱼的免疫保护效率达38.46％。3.商业化佐剂氢氧化铝可以提高免疫保护效果。本专利技术的疫苗应用时添加氢氧化铝佐剂可以提高对石斑鱼的免疫保护效率达50％。附图说明：图1是疫苗蛋白rVP88的原核表达产物的纯化，M:蛋白分子量标准；1-3：亲和层析纯化后的重组蛋白rVP88；4：IPTG诱导的全菌蛋白；具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆使用“Axygen爱思进生物技术(杭州)有限公司”的相应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗，其特征在于，所述的石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗，其特征在于，所述的石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗是SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码的多肽。2.根据权利要求1所述的重组囊膜蛋白疫苗，其特征在于，是所述的SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码的多肽与佐剂氢氧化铝混合形成石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗。3.一种石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，将SEQIDNO.1所示的核苷酸序列转入到表达载体中，再将此表达载体转入宿主菌中，表达SEQIDNO.1所示的核苷酸序列编码的多肽，然后纯化收集此多肽，即得石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的表达载体为质粒pET-32a。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的石斑鱼虹彩病毒的重组囊膜蛋白疫苗是通过以下方法制备的：1)质粒pET-32a-VP88的构建：将质粒pET-32a用EcoRI/SalI酶切，回收5.9kb片段；以新加坡石斑鱼虹彩病毒SGIV基因组DNA为模板，用引物VP88-F和VP88-R进行PCR扩增，产物纯化后用EcoRI/SalI酶切，回收1.5kb片段，将其与上述5.9kb片段连接，连接液转化大肠杆菌DH5α后在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，并筛选转化子提取质粒，即为质粒pET32a-VP88；所述引物VP88-F为5’-GCGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦启伟，周胜，黄晓红，黄友华，魏京广，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44