口蹄疫病毒样颗粒在作为重组质粒运载载体中的应用制造技术

本发明专利技术公开了口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)在作为重组质粒运载载体中的应用。本发明专利技术尝试将口蹄疫VLPs作为质粒运载载体，应用其潜在的运载能力和控释特性，将Asia1型口蹄疫病毒重组质粒成功运载并能在动物体内释放，最终刺激机体产生有效免疫应答反应。结果显示，口蹄疫VLPs可以运载质粒DNA进入细胞并有效释放，在注射进动物体内后，能够有效释放承载的外源质粒DNA，最终诱导特异的抗体免疫反应和显著的T‑淋巴细胞免疫反应。这些结果表明，VLPs可以作为载体运载质粒进入细胞并成功释放，且能在动物机体内有效刺激机体产生特异的免疫反应。本发明专利技术为扩展口蹄疫VLPs的生物学应用进行了一次新的尝试和创新。

Application of foot-and-mouth disease virus like particles in recombinant plasmid delivery vectors

The present invention discloses the application of foot-and-mouth disease virus like particles (VLPs) as carriers for recombinant plasmids. The present invention will try to FMDV VLPs as carrier plasmid vector, its carrying capacity and the potential application of controlled release characteristics, the foot-and-mouth disease virus type Asia1 recombinant plasmid was successfully launch and release in the animal body, eventually induce effective immune response. The results showed that FMD VLPs can carry plasmid DNA into cells and release in injected into animals, can effectively release the plasmid DNA carrying the antibody immune response eventually induce specific and significant T lymphocyte immune response. These results indicate that VLPs can be used as a carrier to carry plasmids into cells and release successfully, and can effectively stimulate the organism to produce specific immune responses in animals. The invention has made a new attempt and innovation for the biological application of the foot and mouth disease VLPs.

【技术实现步骤摘要】
口蹄疫病毒样颗粒在作为重组质粒运载载体中的应用
本专利技术涉及一种口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)的新用途，特别涉及口蹄疫病毒样颗粒在作为重组质粒运载载体中的应用。本专利技术属于农业科学畜牧兽医科学

技术介绍
DNA疫苗是近年来发展起来的一种新型疫苗，它是一种表达某种抗原基因的真核表达质粒，该质粒表达的蛋白在细胞内合成、加工、递呈的过程与完整病毒很相似，能够诱导较强的免疫反应和保护力，而且比传统疫苗具有安全、稳定、更容易构建和生产等优点。因此，目前DNA疫苗已经成为国际疫苗研究领域中的热点，并己在人和动物的多种传染病、寄生虫病以及肿瘤治疗等方面取得进展。实现DNA疫苗有效免疫的前提条件之一是能够将重组质粒DNA运载到细胞内，目前作为质粒DNA的载体有病毒载体及非病毒载体，前者包括腺病毒、痘病毒等，后者主要包括多聚物，如鲑鱼精蛋白、多溶素、PEG、PLA、多聚糖以及以惰性基质材料为主的无机纳米颗粒。但由于这些载体或多或少存在缺陷，其优化还在进行中，为了寻找更有效、更具生物相容性的质粒DNA载体，近年来出现的病毒样颗粒(VLPs)引起了研究者的关注。VLPs是一类形态结构与自然病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)在制备重组质粒运载载体中的应用，优选的，所述的重组质粒为DNA疫苗。

【技术特征摘要】
1.口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)在制备重组质粒运载载体中的应用，优选的，所述的重组质粒为DNA疫苗。2.一种口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物，其特征在于以O型口蹄疫VLPs作为载体，所述的O型口蹄疫VLPs内包被有含有Asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒，所述的含有Asia1型口蹄疫病毒编码基因的重组质粒是将Asia1型口蹄疫病毒的P1-2A和3C片段串联构建到真核表达载体上得到的。3.如权利要求2所述的口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物，其特征在于所述的O型口蹄疫VLPs由O型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP3和VP1组装而成，其中VP1的基因序列为SEQIDNO.1所示，VP3的基因序列为SEQIDNO.2所示，VP0的基因序列为SEQIDNO.3所示。4.如权利要求2所述的口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物，其特征在于所述的Asia1型口蹄疫病毒毒株为Asia1/Jiangsu/China/2005，所述的真核表达载体为pcDNA3.1(+)。5.如权利要求2所述的口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物，其特征在于所述的重组质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。6.一种构建权利要求2所述的口蹄疫病毒VLPs/DNA疫苗复合物的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)小泛素样修饰蛋白融合表达载体pSMA以及pSMK的构建：a.以酿酒酵母基因组DNA为模板，以smt3F与smt3R为引物扩增smt3基因，引物序列如下：smt3F：5’GCCATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAA3’，smt3R：5’GGATCCGAGACCTTAAGGTCTCAACCTCCAATCTGTTCGCGGTG3’，b.经NcoI和BamHI双酶切后将smt3基因插入到用同样内切酶处理的pET-28a载体中，所得载体为pSMK，将pSMK的卡那霉素抗性基因替换为氨苄青霉素抗性基因，得载体pSMA；(2)口蹄疫结构蛋白基因重组表达载体的构建根据已公布的GenBank登陆号为JN998085.1的O型口蹄疫病毒的序列，进行密码子优化并合成结构蛋白基因VP0，VP3和VP1；以合成的基因为模板，以下引物对分别扩增VP0，VP3和VP1基因片段：VP1F：5’GGTCTCTAGGTACCACCAGCACGGGCGAA3’VP1R：5’CGCGGATCCTCACAGACTTTGTTTGACCGG3’VP0F：5’GGTCTCTAGGTGGTGCGGGCCAGTCATCTCC3’VP0R：5’CGCGGATCCTCATTCTTTACTCGGAAATTC3’VP3F：5’GGTCTCTAGGTGGTATCTTCCCGGTGGCGTG3’VP3R：5’CGCGGATCCTCATTGCTGACGGGCATCAACC3’采用聚合酶链式反应方法，分别用引物VP1F/VP1R、VP3F/VP3R和VP0F/VP0R扩增获得VP1、VP3和VP0基因片段；扩增得到的VP1、VP3和VP0基因片段分别经BsmBI/BamHI双酶切后插入经BsaI酶切处理的pSMK或pSMA，所构建重组表达载体分别命名为pSMK...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭慧琛，孙世琪，郜原，靳野，魏衍全，张韵，刘湘涛，李杰林，马军武，冯霞，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62