高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法技术

本发明专利技术涉及高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法。具体而言，本发明专利技术提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)SEQ ID NO:1第229～1035位核苷酸序列所示的序列；和(2)(1)所述序列的互补序列。本发明专利技术还提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)编码下式所示的多肽序列的多核苷酸序列：A‑L1‑B‑L2‑RML；式中，A可存在或不存在，当存在时，为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；L1在A存在时存在，为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；B为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；L2为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；RML表示米黑根毛霉脂肪酶的成熟肽序列；和(2)(1)所述序列的互补序列。

Efficient expression of lipase from Mucor michagen

The invention relates to a method for efficiently expressing Mucor of rice root. In particular, the present invention provides a sequence of polynucleotide, which is selected from the sequence of (1) SEQ ID NO:1 229th ~ 1035 nucleotide sequences, and a complementary sequence of (2) (1) sequence. The present invention also provides a sequence of polynucleotides. The nucleotide sequence is selected from: (1) the nucleotide sequence of the polypeptide sequence shown in the encoded formula: A L1 B L2 RML; in the formula, A can exist or do not exist, when it exists, it is a preconducting peptide for the lipase of Mucor michiran; L1 exists in A and is a protease Kex2 and ste13. The enzyme cutting site; B is the leading peptide of the lipase of Mucor michiran; L2 is the enzyme site of the protease Kex2 and ste13; RML indicates the mature peptide sequence of the lipase of Mucor michiran; and the sequence of (2) (1).

【技术实现步骤摘要】
高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法
本专利技术涉及高效表达米黑根毛霉脂肪酶的方法。
技术介绍
脂肪酶(LipaseEC3..1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业，是重要的工业酶制剂之一。其催化活性仅仅取决于它的蛋白质结构，因而不同来源的脂肪酶具有不同的催化特性和催化活力。目前，已知大约有2％的微生物产脂肪酶，能产脂肪酶的微生物至少包括65个属，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属(Hasan，2006)。其中米黑根毛霉脂肪酶因具有较强sn-1,3选择性以及高活力的特性，已被广泛用于结构脂质(Structuredlipids)的酶法合成，如SOS、OPO、DAG的合成，处理鱼油富集DHA等多不饱和脂肪酸(Pedersen，1995)，以及手性医药中间体及某些生物材料的制备(Fujikih，2009)等。天然的米黑根毛霉脂肪酸产量低、成分不稳定，提取困难等存在较大的缺陷，使得其无法工业化生产。因此，针对RML的研究主要集中在其酶学性质、应用范围以及在基因工程菌中的高效表达。有关RML的报道中，诺维信(Novo)公司研究最为详实。1977年(Moskowitz，1977)，Novo公司研究员对天然RML进行了深入研究，结果表明：RML是一种糖蛋白，可广泛水解动物脂肪和植物油，在pH4-9范围内，室温下一定时间内保持稳定，其中pH6.0时最为稳定。1987年，Novo的Huge-jensen报道天然的米黑根毛霉发酵液中存在RML-A和RML-B两种具有高度免疫原性一致的酶，并阐明二者关系及一级结构。1988年(Boel，1988)，Novo公司Boel和Huge-jensen找到了编码RML的cDNA序列，并确定RML前体蛋白是由RML、70个氨基酸残基的前体肽链及24个氨基酸残基的信号肽构成，通过酶切割酶原蛋白的MET-SER之间的肽键而得到269个氨基酸残基的RML。1989年，Huge-jensen将RML的前体蛋白基因插入至米曲霉的载体中，利用α-淀粉酶基因的启动子和糖化酶的终止子进行表达得到胞外分泌的rRML。利用该表达载体得到的rRML中有70％的N-端氨基酸序列与天然酶一致，而另外的30％的重组酶比天然酶少一个丝苏氨酸残基。此外，重组酶的等电点为4.3与RML一致，含糖量为1.2％，免疫性质也与天然酶高度相似。目前Novo公司市场上销售的RML也是利用基因工程技术以米曲霉为载体表达的基因改性脂肪酶，液体酶商品名为20000L，固定化酶商品名为LipozymeRMIM。尽管真菌米曲霉不失为一种优良的表达载体，但其自身会分泌各种非目标蛋白，如：Novo的LipozymeRM酶液中非目的蛋白淀粉酶的含量远高于目的蛋白RML脂肪酶，另外，还有很多其他杂蛋白如：蛋白酶等，导致其应用受到很大限制。目前，尽管Novo将RML液体经过再次提纯，获得商品名为388的RML，但因价格昂贵，进一步限制了其在工业中的应用。
技术实现思路
本专利技术第一方面提供一种米黑根毛霉脂肪酶的编码序列，所述序列选自：(1)SEQIDNO:1第229～1035位核苷酸序列所示的序列；和(2)(1)所述序列的互补序列。本专利技术第二方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：(1)编码下式I所示的多肽序列的多核苷酸序列：A-L1-B-L2-RML(式I)式中，A可存在或不存在，当存在时，为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；L1在A存在时存在，为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；B为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；L2为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；和RML表示米黑根毛霉脂肪酶的成熟肽序列；和(2)(1)所述序列的互补序列。在一个或多个实施方案中，所述式I所示的多肽序列存在A和L1。在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶前导肽编码序列如SEQIDNO:1第1～210位所示。在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶成熟肽编码序列如SEQIDNO:1第229～1035位所示。在一个或多个实施方案中，所述L1和L2的核苷酸序列各自独立如SEQIDNO:1第211～228位所示，或如SEQIDNO:3第211～234位所示。在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶前导肽如SEQIDNO:2第1～70位所示。在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶成熟肽如SEQIDNO:2第77～345位所示。在一个或多个实施方案中，所述L1和L2的氨基酸序列各自独立如SEQIDNO:2第71～76位所示，或如SEQIDNO:4第71～78位所示。在一个或多个实施方案中，式I所示的多肽序列如SEQIDNO:2或4所示。在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列选自：(i)SEQIDNO:1或3所示的多核苷酸序列；和(ii)(i)所述多核苷酸序列的互补序列。本专利技术第三方面提供一种核酸构建物，该核酸构建物含有本专利技术所述的多核苷酸序列。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有本专利技术第一方面所述的多核苷酸序列。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有本专利技术第二方面所述的多核苷酸序列。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。在一个或多个实施方案中，所述表达载体为适用于毕赤酵母中表达的载体，包括但不限于pPIC、pPICZ、pAO、pGAP和pGAPZ。在一个或多个实施方案中，所述表达载体以pAO815质粒为骨架。本专利技术第四方面提供一种遗传工程化的宿主细胞，其含有本专利技术所述的多核苷酸序列或核酸构建物。在一个或多个实施方案中，所述细胞为酵母。在一个或多个实施方案中，所述酵母为毕赤酵母。本专利技术第五方面提供一种制备米黑根毛霉脂肪酶的方法，该方法包括构建含本专利技术所述多核苷酸序列的表达载体，将其转入宿主细胞中，以及培养所述宿主细胞以表达所述脂肪酶的步骤。本专利技术第五方面提供一种构建能提高米黑根毛霉脂肪酶表达量的表达载体的方法，所述方法包括将在米黑根毛霉脂肪酶前导肽编码序列和成熟肽编码序列之间插入了蛋白酶kex2和ste13的酶切位点的基因序列插入表达载体中的步骤。在一个或多个实施方案中，所插入的基因序列中，在所述米黑根毛霉脂肪酶前导肽编码序列之前还包括一个拷贝的米黑根毛霉脂肪酶前导肽编码序列及蛋白酶kex2和ste13的酶切位点。在一个或多个实施方案中，所述基因序列已按照毕赤酵母密码子的偏爱性进行优化。在一个或多个实施方案中，所述表达载体适于在酵母中表达。在一个或多个实施方案中，所述表达载体适于在毕赤酵母中表达。在一个或多个实施方案中，所述表达载体以pAO815质粒为骨架。在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶前导肽编码序列如SEQIDNO:1第1～210位所示。在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶成熟肽编码序列如SEQIDNO:1第229～1035位所示。在一个或多个实施方案中，所述蛋白酶kex2和ste13的酶切位点的核苷酸序列如SEQIDNO:1第211～228位所示或如SEQIDNO:3第211～234位所示。在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉脂肪酶前导肽如SEQIDNO:2第1～70位所示。在一个或多个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列选自：(1)SEQ ID NO:1第229～1035位核苷酸序列所示的序列；和(2)(1)所述序列的互补序列。

【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列选自：(1)SEQIDNO:1第229～1035位核苷酸序列所示的序列；和(2)(1)所述序列的互补序列。2.一种多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列选自：(1)编码下式I所示的多肽序列的多核苷酸序列：A-L1-B-L2-RML(式I)式中，A可存在或不存在，当存在时，为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；L1在A存在时存在，为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；B为米黑根毛霉脂肪酶前导肽；L2为蛋白酶kex2和ste13的酶切位点；和RML表示米黑根毛霉脂肪酶的成熟肽序列；和(2)(1)所述序列的互补序列。3.如权利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于，式I所示的多肽序列存在A和L1；和/或所述L1和L2的氨基酸序列各自独立如SEQIDNO:2第71～76位所示，或如SEQIDNO:4第71～78位所示；优选地，式I所示的多肽序列如SEQIDNO:2或4所示。4.如权利要求2或3所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列选自：(i)SEQIDNO:1或3所示的多核苷酸序列；和(ii)(i)所述多核苷酸序列的互补序列。5.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有权利要求1－4中任一项所述的多核苷酸序列；优选地，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体；更优选地，所述表达载体为适用于毕赤酵母中表达的载体，包括但不限于pPIC、pPICZ、pAO、pGAP和pGAPZ；更优选地，所述表达载体以pAO815质粒为骨架。6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求1－4中任一项所述的多核苷酸序列或权利要求5所述的核酸构建物；优选地，所述细胞为酵母细胞；更优选地，所述酵母为毕赤酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：宣姚吉，徐正军，牛其文，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31