一种分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法，属于食品安全免疫检测领域。所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.14696，是将BALB/c小鼠用完全弗氏佐剂进行首次免疫，不完全弗氏佐剂进行3次加强免疫，不含佐剂的克拉霉素完全抗原进行1次冲击免疫，使得BALB/c小鼠获得免疫；将高效价低IC50的获得免疫的小鼠脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到的细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对克拉霉素具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.3ng/ml)可以用于食品中克拉霉素的残留检测。

【技术实现步骤摘要】
一种分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法
本专利技术涉及一种分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及制备方法，属于食品安全免疫检测领域。
技术介绍
克拉霉素(Cyproheptadine，CHP)属于大环内酯类抗生素，是第二代红霉素产品，具有稳定性好,杀菌能力强，对大多数革兰阳性菌、部分革兰氏阴性菌及一些支原体衣原体均有较强杀菌效果，广泛用于治疗呼吸道、伤口、生殖泌尿系统感染。因此，许多不良厂家在动物饲料和动物饮水中非法添加这种药物以增加动物成活率，获得非法暴利。然而，这种非法行为会造成动物体内药物残留，克拉霉素大量堆积于动物体内，人食用这些动物后，这些残留的药物转而堆积在人的体内，克拉霉素长期持续给药可造成恶心、胃灼热、腹痛腹泻、头痛；还能引起药热、药疹、荨麻疹等过敏反应；此外，对于中枢神经具有副作用，严重危害人体的健康。因此，我们急需找到一种特异性强、灵敏度高的检测食品中克拉霉素残留的方法。目前，检测克拉霉素的方法主要是气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)以及气质联用(GC-MS)、液质联用(LC-MS)等仪器，但这些方法都需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂，成本高，时间长，不能实现大量样品的快速检测。因此建立一种快速简便的检测方法具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测克拉霉素的前提是得到对克拉霉素具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对克拉霉素具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。专利技术人尝试通过杂交瘤细胞制备克拉霉素单克隆抗体，但在制备能分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备克拉霉素完全抗原、如何建立小鼠免疫，还需进一步的研究；制备出的杂交瘤细胞株是否能分泌出克拉霉素单克隆抗体，也需进一步验证；出的克拉霉素单克隆抗体特异性、灵敏度如何，更需进一步验证。
技术实现思路
本专利技术的目的是获得一种能分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及此细胞株的制备方法，采用本专利技术获得的能分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌的克拉霉素单克隆抗体对克拉霉素具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.3ng/ml)；HPLC-MS测定克拉霉素含量，最低检测限为2ng/mL，可以用于建立克拉霉素的免疫学检测方法，检测食品中克拉霉素的残留。本专利技术提供了一种分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2017年9月5号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo.14696。本专利技术提供了一种分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：步骤一：制备克拉霉素半抗原及克拉霉素完全抗原，将获得的克拉霉素完全抗原制备成弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；步骤二：将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；步骤三：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，删选出血清中克拉霉素抗体含量高的获得免疫的小鼠；步骤四：将删选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲击免疫，冲击免疫采用不含弗氏佐剂的克拉霉素完全抗原进行；步骤五：通过聚乙二醇(PEG4000)法将进行冲击免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选出获得能分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株；步骤六：将获得的能分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株通过间接ELISA法测定其分泌的抗体的灵敏度和特异性；所述步骤一中的克拉霉素半抗原的分子式如下：所述步骤一中的克拉霉素抗原的分子式如下：在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤二、步骤四中，首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲击免疫之间间隔21天。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤二、步骤四中，首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲击免疫剂量为25μg/只。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤二、步骤四中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲击免疫；在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤三中，采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤六中，细胞融合是在冲击免疫结束3天后进行。本专利技术提供了一种分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株的应用，所述杂交瘤细胞可用于制备克拉霉素单克隆抗体。本专利技术提供了一种克拉霉素半抗原，分子式如下：本专利技术提供了一种克拉霉素半抗原的制备方法，反应式如下：本专利技术提供了一种克拉霉素半抗原的制备方法，称取克拉霉素(CLA)充分溶解于无水吡啶中，边加边搅拌加入羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)，水浴避光搅拌，活化，反应结束后氮气吹干，溶解于甲醇溶液中，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，旋转蒸干，得白色雪花状固体，即为半抗原CLA-CMO。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是称取100mg克拉霉素(CLA)充分溶解于10mL无水吡啶中，边加边搅拌加入29.2mg羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)，于37℃水浴避光搅拌，活化5h，反应结束后氮气吹干，溶解于8mL甲醇溶液中，用10mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，旋转蒸干，得白色雪花状固体，即为半抗原CLA-CMO。本专利技术提供了一种克拉霉素半抗原的应用，所述半抗原可用于包括制备克拉霉素完全抗原、制备克拉霉素抗体、制备分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术提供了一种克拉霉素完全抗原，分子式如下：本专利技术提供了一种克拉霉素完全抗原的制备方法，反应式如下：本专利技术提供了一种克拉霉素完全抗原的制备方法，取CLA-CMO、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，用无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，室温条件下活化，将上述活化后的CLA-CMO溶液缓慢逐滴加入匙孔血蓝蛋白KLH溶液中，室温搅拌反应过夜，即得CLA-CMO-KLH完全抗原混合液，透析并鉴定。在本专利技术的一种实施方式中，称取10.8mgCLA-CMO、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)7.56mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)4.56mg，用800uL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，室温条件下活化8h，将上述活化后的CLA-CMO溶液缓慢逐滴加入匙孔血蓝蛋白KLH溶液中，室温搅拌反应过夜，即得CLA-CMO-KLH完全抗原混合液，4℃透析三天，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。本专利技术提供了一种克拉霉素抗原的应用，所述抗原可用于包括制备克拉霉素抗体、制备分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术提供了一种克拉霉素单克隆抗体，其特征在于，所述抗体从保藏编号为CGMCCNo.14696的杂交瘤细胞株获得。本专利技术提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2017年9月5号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14696。

【技术特征摘要】
1.一种分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2017年9月5号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo.14696。2.如权利要求1所述的一种分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤一：制备克拉霉素半抗原及克拉霉素完全抗原，将获得的克拉霉素完全抗原制备成弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；步骤二：将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；步骤三：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，删选出血清中克拉霉素抗体含量高的获得免疫的小鼠；步骤四：将删选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲击免疫，冲击免疫采用不含弗氏佐剂的克拉霉素完全抗原进行；步骤五：通过聚乙二醇(PEG4000)法将进行冲击免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选出获得能分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株；步...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡华，曾露，胥传来，徐丽广，刘丽强，宋珊珊，吴晓玲，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，无锡迪腾敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32