杂交瘤细胞株及抗人CTRP3的单克隆抗体和其应用制造技术

本发明专利技术涉及杂交瘤细胞株及抗人CTRP3的单克隆抗体和其应用。所涉及的杂交瘤细胞株的保藏编号分别为：CCTCC NO:C201794和CCTCC NO:C201795。所涉及的抗体为本发明专利技术的杂交瘤细胞株分泌的抗体。所涉及的应用为本发明专利技术的抗体用于检测人CTRP3的应用以及本发明专利技术的抗体用于制备人CTRP3检测试剂盒的应用。

Hybridoma cell lines and monoclonal antibodies against human CTRP3 and their application

The invention relates to hybridoma cell lines and monoclonal antibodies to human CTRP3 and their applications. The preservation numbers of hybridoma cell lines involved are: CCTCC NO:C201794 and CCTCC NO:C201795. The antibodies involved are antibodies secreted by hybridoma cell lines of the invention. The application of the invention is the application of the antibodies of the invention to the detection of human CTRP3 and the application of the antibodies of the invention to the preparation of human CTRP3 detection kits.

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株及抗人CTRP3的单克隆抗体和其应用
本专利技术涉及杂交瘤细胞株、抗体及其应用，具体涉及用于检测人CTRP3的杂交瘤细胞株、抗体及其应用。
技术介绍
C1qandtumornecrosisfactorrelatedprotein3(CTRP3)主要是由脂肪细胞或成纤维细胞分泌的脂肪细胞因子，在肾脏、小肠、肺脏及成纤维细胞等器官、组织细胞中也有所表达。CTRP3由分泌信号肽、胶原结构域及C端球状结构域构成，成熟蛋白不含其N端信号肽(22个氨基酸残基)。C端球状结构域与C1q结构类似，可以与其他蛋白或者受体相互作用，因此被认为是其功能结构域。CTRP3具有以下功能：(1)在糖脂代谢调节、炎症反应抑制、心血管保护及减少细胞凋亡和坏死等方面具有作用。(2)能够减轻糖脂代谢紊乱、炎症反应及免疫功能不全等代谢相关疾病；(3)CTRP3能够减少肝糖输出、促进脂肪细胞分化和脂肪酸存储；(4)CTRP3的水平也有望成为糖尿病及代谢综合征的标志分子；(5)CTRP3能够抑制NF-κB、TGF-β等信号通路参与的IL-6和TNF-α等促炎因子的释放，抑制炎症反应；(6)CTRP3具有诱导骨肉瘤细胞生成、促进软骨细胞增殖、诱导脂肪细胞分化、促进血管壁平滑肌细胞增殖及心肌保护等生理作用，可以减轻心肌梗死后大鼠的心肌重构和纤维化；(7)CTRP3有望在治疗代谢综合征和心力衰竭等方面发挥重要作用。目前用于人CTRP3定量检测的方法只有ELISA法，较为可靠的产品均是进口产品，但是也存在偏差较高、价格昂贵、操作时间长、不利于大规模检测人CTRP3含量等缺点。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷或不足，本专利技术提供了一对用于产生抗人CTRP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株：XA297-2，该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：C201794，该培养物为杂交瘤细胞株，保藏时间：2017年6月29日，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学；XA97-5，该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：C201795，该培养物为杂交瘤细胞株，保藏时间：2017年6月29日，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学。本专利技术的杂交瘤细胞株产生的抗体序列：XA297-2重链可变区序列如SEQ.ID.NO.1所示；轻链可变区序列如SEQ.ID.NO.2所示。本专利技术XA297-5重链可变区序列如SEQ.ID.NO.3所示；轻链可变区序列如SEQ.ID.NO.4所示。本专利技术的杂交瘤细胞株分泌产生的抗人CTRP3单克隆抗体。本专利技术抗体用于检测人CTRP3的应用。进一步，本专利技术的抗体用于制备人CTRP3检测试剂盒的应用。本专利技术还提供了人CTRP3检测试剂盒。所提供的人CTRP3检测试剂盒包括上述抗体。本专利技术的还包括：样品稀释液、底物稀释液、底物、洗涤液、标准品和非离子活性剂。本专利技术建立了一种可靠的、灵敏的、特异性强、成本低费定量检测人CTRP3含量的ELISA试剂盒及其制备方法和应用。附图说明图1为重组人CTRP3蛋白的电泳图，1、Marker；2、破碎沉淀；3、镍柱流穿液；4、100mM咪唑洗脱液；5、500mM咪唑洗脱液；6、重组人CTRP3蛋白。图2本专利技术所述试剂盒典型标准曲线。具体实施方式以下通过实施例对本专利技术做进一步的阐述。实施例是对本专利技术进行详细说明，但本专利技术并不受这些的任何限定。以下实施例中使用的辣根过氧化物酶(HRP)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；基因序列优化、合成克隆由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成；抗体测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；Ni-NTA纯化柱购自GE公司；内毒素去除柱购自赛默飞世尔(中国)有限公司；DMEM高塘培养基、胎牛血清为Hycolon公司产品。实施例1：本专利技术杂交瘤细胞株及抗体的制备根据人CTRP3序列(GenBankACCESSIONNM_030945.3)开放阅读框序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，进行全基因合成(序列如SEQ.ID.NO.5所示)，将合成的基因连接于pET30a(+)的EcoRI和HindIII之间，采用IPTG(终浓度1mM)进行16℃，200rpm过夜诱导表达，4000g离心收获菌体。超声破碎后，12000g离心取上清。上清经过镍柱亲和纯化，采用咪唑浓度梯度洗脱后，通过透析更换为PBS缓冲液，采用MilliporeUtral-15浓缩，除去内毒素后，即为重组人CTRP3蛋白(参见附图1)。选取6-8周龄Balb/C雌性小鼠，CTRP3蛋白作为抗原，为获得高亲和力抗体，采用小剂量(约1μg)、长时程，多次免疫的方法，选择免疫10天后，采用间接ELISA方法检测血清效价(包被抗原为酶切并纯化的蛋白)，效价达到1∶5万以上准备融合。取经加强免疫的小鼠脾脏，研磨破碎，过滤洗涤之后，制成细胞悬液并计数；骨髓瘤SP2/0细胞生长至对数期，离心收集并洗涤，与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合，室温下采用PEG进行促融合，将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，置37℃，5％CO2，相对饱和湿度培养箱中培养。在融合24小时后，依次采用5×HAT选择培养液、1×HAT/HT选择培养液和1×HT培养液进行融合骨髓瘤细胞筛选。采用间接ELISA方法阳性克隆(包被抗原为酶切并纯化的蛋白)并进行连续克隆化。最终筛选得到能够稳定分泌抗CTRP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为XA297-2和XA297-5，均保藏于中国典型培养物保藏中心,地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号分别为：CCTCCNO:C201794和CCTCCNO:C201795。抗体的制备：取8-10周龄BABL/C雌性小鼠，按照200μL/只，腹腔注射石蜡油，1-2周之后，杂交瘤细胞株(CCTCCNO:C201794或CCTCCNO:C201795)，以106个/只的量，腹腔注射，7-10天后，采集小鼠腹水，用间接ELISA方法检测单抗的效价。腹水4℃、12000rpm离心15min，与2倍体积的醋酸缓冲液(0.06M，pH4.8)混合，逐滴加入正辛酸，室温搅拌30min，4℃静置其充分沉淀。离心后取上清过滤，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.4)，并用2MNaOH调节pH至7.4。采用硫酸铵沉淀将抗体沉淀，离心后取沉淀，用含有0.2mMEDTA磷酸盐缓冲液溶解，并透析过夜。用本领域常用BCA法测定抗体含量，用间接ELISA法检测抗体效价。抗体的测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，其步骤为：杂交瘤细胞采用RPMI1640加20％血清培养24h，离心，弃去上清，采用TriZol重悬细胞，106个细胞/mL。提取DNA后，采用RT-PCR扩增重链和轻链基因，克隆至T载体后进行DNA测序。抗体命名为：XA297-2重链可变区(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)：EVMVVESGGGSVKPGGSLKLSCAASGFTFNNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGGYIYYSDSVKGRFTISRDTAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTRRGLPIDAMDYWGQGTSVTVSS；XA297-2轻链可变区(FR1本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于制备抗人CTRP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO：C201794。

【技术特征摘要】
1.用于制备抗人CTRP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCCNO：C201794。2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株所产生的抗人CTRP3单克隆抗体。3.如权利要求2所述的抗体，其特征在于，该抗体的重链可变区序列如SEQ.ID.NO.1所示；轻链可变区序列如SEQ.ID.NO.2所示。4.权利要求2所述抗体用于检测人CTRP3的应用。5.用于制备抗人CTRP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCCNO：C2...

【专利技术属性】
技术研发人员：易蔚，谭延振，孙阳，冯攀，张正斌，张冰，朱丽雯，刘金城，梁宏亮，段维勋，俞世强，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61