牛单核细胞趋化蛋白-1杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术提供了分泌抗牛单核细胞趋化蛋白1(MCP‑1)单克隆抗体的杂交瘤细胞株4G9，以及其分泌的单克隆抗体MAb 4G9。该单克隆抗体MAb 4G9具有效价高、特异性好、与天然牛MCP‑1抗原亲和力强的优势，基于此建立的Western‑Blot检测试剂盒、直接免疫荧光(DFA)检测试剂盒和流式细胞术(FCM)检测试剂盒，具有良好的灵敏度和特异性，可以用作重组牛MCP‑1的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、进出口检验检疫、流行病学研究等非诊断目的研究。

Bovine monocyte chemoattractant protein -1 hybridoma cell line, monoclonal antibody secreted and its application

The present invention provides hybridoma cell line 4G9 secreting monoclonal antibodies against bovine monocyte chemoattractant protein 1 (MCP 1) and its secreted monoclonal antibody MAb 4G9. The monoclonal antibody MAb 4G9 has the advantages of high effective price, good specificity and strong affinity with the natural bovine MCP antigen 1 antigen. Based on this established Western Blot detection kit, direct immunofluorescence (DFA) detection kit and flow cytometry (FCM) detection kit, it has good sensitivity and specificity and can be used as a recombinant bovine MC. Detection of P 1, identification of in vitro tissues, identification of epitopes, import and export inspection and quarantine, epidemiological studies, and other non diagnostic purposes.

【技术实现步骤摘要】
牛单核细胞趋化蛋白-1杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及应用
本专利技术涉及一种杂交瘤细胞株，特别是涉及分泌抗牛单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)单抗的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及应用。
技术介绍
单核细胞趋化蛋白1(Monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)是趋化因子CC亚家族的一员。MCP-1主要趋化单核细胞，使各种炎性细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集，从而在机体防御、慢性炎症及抗肿瘤等方面起重要作用。血液中的单核细胞在特异的趋化因子作用下，发生迁移并聚集在不同病变组织中发挥重要的生物学效应，如吞噬和杀伤病原微生物，递呈抗原及分泌多种生物活性物质等。研究显示MCP-1表达水平的改变与感染性疾病、免疫功能异常、炎症性疾病与肿瘤的发展等有一定相关性。MCP-1的免疫学检测是在特异性抗MCP-1单克隆抗体(MAb)的基础上建立的用于对样本中的MCP-1进行定性定量分析的实验方法。应用不同的单克隆抗体标记物和检测技术，可建立多种检测方法，如酶免疫分析法(EnzymeImmunoassay，EIA)，酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay，简称ELISA)，流式细胞术(FlowCytometry，简称FCM)分析法等。MCP-1的FCM具有高度敏感性和应用广泛性。作为细胞免疫状态的重要指标之一，MCP-1的FCM检测方法被广泛地用于研究基础和临床医学、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及多种病原微生物感染的诊断等。但是，现有技术中制备的抗牛MCP-1(BoMCP-1)抗体，在应用于上述检测方法时往往遇到很大问题，特别是当用于检测天然牛MCP-1时效果不佳。因此，获得一种可用于牛临床检测的，效价高、特异性好、与天然牛MCP-1有抗原亲和力的牛MCP-1单抗，对牛机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究具有重要的意义。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种分泌牛MCP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株以及该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在牛免疫检测领域的应用。所述杂交瘤细胞株分泌的抗牛MCP-1的单克隆抗体效价高，其能与天然牛MCP-1的高亲和力地特异结合，其作为诊断试剂检测牛MCP-1，具有相当的灵敏度和特异性。本专利技术第一方面提供了一种分泌牛MCP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株4G9或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株4G9保藏号为CCTCCNO:C2017281。本专利技术第二方面提供了一种牛MCP-1单克隆抗体4G9，其由上述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。本专利技术第三方面提供了一种牛MCP-1的Western-Blot检测试剂盒，所述Western-Blot检测试剂盒包括检测抗体、细菌脂多糖LPS刺激剂，其中，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的上述牛MCP-1单克隆抗体4G9(HRP-4G9)。本专利技术第四方面提供了一种牛MCP-1的直接免疫荧光DFA检测试剂盒，所述直接免疫荧光DFA检测试剂盒包括检测抗体、细菌脂多糖LPS刺激剂，其中，所述检测抗体为异硫氰酸荧光素标记的上述牛MCP-1单克隆抗体4G9(FITC-4G9)。本专利技术第五方面提供了一种牛MCP-1的FCM检测试剂盒，所述FCM检测试剂盒包括检测抗体、细菌脂多糖LPS刺激剂，其中，所述检测抗体为异硫氰酸荧光素标记的上述牛MCP-1单克隆抗体4G9(FITC-4G9)。本专利技术第六方面提供了上述分泌牛MCP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株或上述牛MCP-1单克隆抗体MAb4G9在制备牛机体免疫状态的检测试剂或诊断试剂中的应用。本专利技术第七方面提供了所述Western-Blot检测试剂盒、直接免疫荧光DFA检测试剂盒或FCM检测试剂盒在用于非诊断目的检测牛MCP-1中的应用，所述非诊断目的检测包括重组表达牛MCP-1的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、进出口检验检疫、流行病学研究。本专利技术的技术效果：本专利技术的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原结合亲和力强的优势，可用于检测天然牛MCP-1。基于此建立的Western-Blot检测试剂盒，可以有效检测大肠杆菌表达系统表达的牛MCP-1蛋白和牛外周血单核细胞(PBMC)分泌的天然牛MCP-1蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。基于此建立的直接免疫荧光(DFA)检测试剂盒，可以有效检测真核质粒表达分泌的牛MCP-1和牛外周血单核细胞分泌的牛MCP-1，具有较好的灵敏度和特异性。同时，基于此建立的牛MCP-1的FCM检测试剂盒，在检测牛外周血单个核细胞样品时，可以检测出较高水平的分泌牛MCP-1的单核细胞，具有较好的灵敏度和特异性。附图说明图1为本专利技术Western-Blot方法的重组牛MCP-1蛋白检测结果图：A.重组His-BoMCP-1蛋白检测结果，B.重组GST-BoMCP-1蛋白检测结果。图2为本专利技术直接免疫荧光(DFA)方法的牛外周血单核细胞样品检测结果图：A.未刺激牛外周血单核细胞检测结果，B.LPS刺激牛外周血单核细胞结果。图3为本专利技术FCM试剂盒的牛外周血单核细胞样品检测结果图：A.未刺激牛外周血单核细胞检测结果，B.LPS刺激牛外周血单核细胞结果。具体实施方式以下对本专利技术的实施方式进行说明。本专利技术目的是提供一种分泌牛MCP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测领域的应用。本专利技术一方面提供了一种分泌牛MCP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株4G9或其传代细胞株。所述杂交瘤细胞株4G9保藏号为CCTCCNO:C2017281；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2017年12月7日。本专利技术第二方面提供了一种本专利技术所述的杂交瘤细胞株4G9或其传代细胞株分泌产生的牛MCP-1单克隆抗体4G9。本专利技术第三方面提供了一种牛MCP-1的Western-Blot检测试剂盒，所述Western-Blot检测试剂盒包括检测抗体、细菌脂多糖LPS刺激剂，其中，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的上述牛MCP-1单克隆抗体4G9(HRP-4G9)。优选地，所述Western-Blot检测试剂盒还包括下列试剂的一种或几种：1)封闭液；2)底物液；以及3)洗涤液。本专利技术的Western-Blot检测试剂盒可用于检测重组牛MCP-1蛋白。利用本专利技术的Western-Blot检测试剂盒检测重组牛MCP-1蛋白的方法包括下列步骤：1.SDS-PAGE电泳，将纯化蛋白rHis-BoMCP-1、rGST-BoMCP-1分别加入蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳；2.转印，电泳结束后，将凝胶置于转印Buffer中浸泡5min，同时将NC膜和滤纸同样浸泡，按照从上到下为2张滤纸-NC膜-凝胶-2张滤纸的顺序，铺好后转至半干转印仪中，注意排去气泡。在Bio-Radsemi-DrytransferCell系统中以0.8mA/cm2转印2h；3.检测，①用含5％脱脂奶的PBS封闭，室温摇晃封闭过夜；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分泌牛MCP‑1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株4G9或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株4G9保藏号为CCTCC NO:C2017281。

【技术特征摘要】
1.一种分泌牛MCP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株4G9或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株4G9保藏号为CCTCCNO:C2017281。2.一种牛MCP-1单克隆抗体MAb4G9，其由根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。3.一种检测牛MCP-1的Western-Blot检测试剂盒，所述Western-Blot检测试剂盒包括检测抗体、细菌脂多糖LPS刺激剂，其中，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的根据权利要求2所述的牛MCP-1单克隆抗体4G9。4.根据权利要求3所述Western-Blot检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括下列试剂的一种或多种：1)封闭液；2)底物液；以及3)洗涤液。5.一种检测牛MCP-1的直接免疫荧光DFA检测试剂盒，所述直接免疫荧光DFA检测试剂盒包括检测抗体、细菌脂多糖LPS刺激剂，其中，所述检测抗体为异硫氰酸荧光素标记的根据权利要求2所述的牛MCP-...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，陈祥，徐正中，夏爱鸿，刘泽，李昕，朱兆成，孟闯，潘志明，殷月兰，孙林，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32