分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用提纯的水稻条纹花叶病毒(RSMV)为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗RSMV单抗的杂交瘤细胞株1D4，其保藏号为CGMCC No.14898。该杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水间接ELISA效价达到10‑10，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链。该单抗与RSMV的N蛋白有特异性反应。利用1D4单抗为核心建立检测RSMV的ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法，这两种方法检测病叶的灵敏度分别达到1:2621440和1:40960倍稀释(w/v,g/mL)。该杂交瘤细胞株及其单抗的获得和血清学检测方法的建立为该病毒病的检测诊断及科学防控提供了物质和技术支撑。 1

【技术实现步骤摘要】
分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
技术介绍
水稻是我国乃至世界的重要粮食作物之一，而每年水稻病毒病对我国水稻产量造成了严重损失。2015年，在广东省罗定市太平镇田发现了一种新的水稻病毒病害，它的症状不同于已报道各种水稻病毒病，其为弹状病毒科细胞质弹状病毒属一个新种，命名为水稻条纹花叶病毒(Ricestripemosaicvirus,RSMV)。就目前所知，该病毒是迄今为止唯一自然侵染水稻的细胞质弹状病毒，也是首个经叶蝉传播的细胞质弹状病毒。RSMV感染植株轻度矮缩，叶片呈条纹花叶状，且有部分病叶表现扭曲，病株可抽穗，但抽穗不完全且籽粒空瘪。3叶期稻苗经电光叶蝉传毒接种后10天，新叶出现明显黄色条纹，随后叶片表现为花叶，叶尖向内侧卷曲。除了水稻外，在发病田或邻近田块的马唐草和鸭舌草中也检测到RSMV的存在。RSMV病毒粒子呈杆状，有包膜，大部分成熟的毒粒子大小长300-360nm，宽45-55nm，其中一些断裂的病毒粒子最小长度为130nm；病毒粒子在细胞质中聚集并形成大量的晶格状，几乎充满整个细胞质空间，而细胞核内未观察到病毒粒子。此外，在晶格状附近有电子半透明颗粒及纤维状的病毒基质，这是病毒复制的场所。有些病毒粒子聚集在囊泡内。这些病毒粒子存在于叶肉细胞及维管束系统。在RSMV基因组的互补链上预测有7个ORFs，推测这7个ORFs的编码蛋白与多数弹状病毒的编码蛋白相似，ORF1预测编码病毒N蛋白；ORF2编码病毒的P蛋白；ORF3编码蛋白是一个碱性的膜蛋白，且该蛋白可能具有运动蛋白的功能；ORF4推测编码M蛋白；ORF5预测编码病毒G蛋白；ORF6推测编码一个辅助蛋白；ORF7预测编码病毒的L蛋白。RSMV的传播介体是电光叶蝉，其能以高效持久的方式传播RSMV。目前，根据症状观察判断田间水稻条纹花叶病毒的发生情况仍然是最主要的方法，但病毒侵染前期水稻没有任何症状，且多种病毒病造成的症状极为相似，另外，常有病毒复合侵染情况，因此依靠症状观察得到的结果缺乏准确性和科学性。电镜观察病毒粒子需要昂贵的仪器，且有些不同病毒粒子的大小和形态有相似性，导致其仅作为一种辅助检测手段。基于PCR方法的分子检测技术虽然灵敏，但是不适于大规模样品的检测。而血清学方法简单易操作、快速、灵敏、成本较低，且适用于田间样品的大规模检测，是目前理想的植物病毒的检测技术。但血清学方法必须依赖于特异、灵敏的优质抗体。目前，国内外未见任何准对该病毒的抗体报道和专利申请。为此，本专利技术专利主要针对水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的制备及其检测应用开展工作，利用杂交瘤技术制备了1株能分泌抗RSMV单抗杂交瘤细胞1D4，并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法，从而为我国水稻条纹花叶病毒的检测、诊断及病害的科学防控提供物质和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。分泌抗水稻条纹花叶病毒单抗杂交瘤细胞1D4，它能分泌抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株1D4于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14898。抗水稻条纹花叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-10，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单抗与水稻条纹花叶病毒60kDa的N蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，该单抗检测感染水稻条纹花叶病毒水稻病叶的灵敏度分别达到1:2621440和1:40960倍稀释(w/v,g/mL)。抗水稻条纹花叶病毒的单克隆抗体与水稻条纹花叶病毒有特异性免疫反应，而与水稻条纹病毒(RSV)、水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)、南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)、水稻锯齿矮缩病毒(RRSV)、水稻瘤矮病毒(RGDV)以及健康水稻植物组织和非携毒电光叶蝉组织均不发生任何免疫反应。抗水稻条纹花叶病毒的单克隆抗体在水稻条纹花叶病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株1D4分泌抗水稻条纹花叶病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测水稻条纹花叶病毒；2)利用本专利技术所制备的单抗检测水稻条纹花叶病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本专利技术所制备的单抗可有效地用于田间水稻及传毒介体电光叶蝉体内RSMV的检测和诊断，也可用于该病毒病的流行病学调查、病毒基因组功能分析、抗性育种、科学防控等方面。附图说明图1是dot-ELISA方法检测水稻中RSMV的灵敏度分析；CK+为感染RSMV的水稻病叶粗提液，CK-为健康水稻叶片粗提液。图2是dot-ELISA方法检测RSMV的特异性分析：1列上下2个点为1个感染RSMV水稻植物样品的2个生物学重复；2列上下2个点为1个感染RSMV电光叶蝉的2个生物学重复；3列上下2个点为1个感染RSV水稻植物样品的2个生物学重复；4列上下2个点为1个感染RBSDV水稻植物样品的2个生物学重复；5列上下2个点为1个感染RRSV水稻植物样品的2个生物学重复；6列上下2个点为1个感染SRBSDV水稻植物样品的2个生物学重复，7列上下2个点为1个感染RGDV水稻植物样品的2个生物学重复；8列上下2个点为1个感健康水稻植物样品的2个生物学重复。图3是dot-ELISA方法检测田间水稻样品中RSMV的代表性结果。生物保藏分泌抗水稻条纹花叶病毒单抗杂交瘤细胞1D4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日为2017年12月15日，保藏号为CGMCCNo.14898。具体实施方式分泌抗水稻条纹花叶病毒单抗杂交瘤细胞株1D4于2017年12月15日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14898，它能分泌抗水稻条纹花叶病毒的单克隆抗体。抗水稻条纹花叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-10，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，能与水稻条纹花叶病毒60kDa的N蛋白有特异性免疫反应，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现，该单抗检测感染RSMV水稻病叶的灵敏度分别达到1:2621440和1:40960倍稀释(w/v,g/mL)。抗水稻条纹花叶病毒的单克隆抗体与水稻条纹花叶病毒有特异性免疫反应，而与水稻条纹病毒(RSV)、水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)、南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)、水稻锯齿矮缩病毒(RRSV)、水稻瘤矮病毒(RGDV)以及健康水稻植物组织和非携毒电光叶蝉组织均不发生任何免疫反应。抗水稻条纹花叶病毒的单抗在该病毒检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学检测试剂盒。本专利技术提供的杂交瘤细胞株1D4能大量分泌抗水稻条纹花叶病毒的单抗，且其分泌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D4，其特征在于能分泌

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D4，其特征在于能分泌抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗，杂交瘤细胞株1D4于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.14898。2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株1D4分泌的抗水稻条纹花叶病毒的单克隆抗体。3.如权利要求2所述的杂交瘤细胞株1D4分泌的抗水稻条纹花叶病毒的单克隆抗体，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10-10，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该抗体能够与水稻条纹花叶病毒60kDa的N蛋白有特异性免疫反应，利用ACP...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，王亚琴，周雪平，陈蕊，黄德青，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33