分泌抗中国小麦花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗中国小麦花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用差速离心的方法提纯的中国小麦花叶病毒病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗中国小麦花叶病毒特异、灵敏的单克隆抗体的杂交瘤细胞株18A3，其保藏号为CGMCCNo.9337。该杂交瘤细胞分泌的单抗腹水ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。18A3分泌的单抗与中国小麦花叶病毒有特异性反应，而不与小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、水稻条纹病毒、烟草花叶病毒等反应。该杂交瘤细胞株及其分泌的单抗为该小麦病毒病的诊断、检测及科学防控提供技术和物质支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗中国小麦花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
技术介绍
中国小麦花叶病是一类由土壤中真菌传播的病毒引起的病害，传播的主要生物媒介是一种习居于土壤中的低等真菌，即禾谷多黏菌（Polymyxa graminis Led.），病原为中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）,并常与小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）复合侵染小麦。这两类病毒都属于真菌传棒状病毒组。在电子显微镜下观察，病毒粒体为直棒状二分体，即具有长、短两种形状，长粒体长约为360纳米，短粒体长约为80纳米，病毒粒体直径约为20纳米。我国自20世纪70年代发生有禾谷多黏菌传播的大、小麦病毒病以来，目前已有河南、四川、湖北、陕西、山东、江苏、浙江、安徽和上海等9个省发生此类病害，发病面积达200万公顷，每年减产约15亿千克，并且病害尚在蔓延中。造成病害迅速蔓延，危害严重的原因在于传播这类病毒的介体禾谷多黏菌具有厚壁休眠孢子，抗逆性极强，且能在土壤中长期存活，携带的病毒十年后还具有侵染力，不能通过化学方法得以防治。病毒种类和株系复杂，变异快，新病毒致病型和株系不断出现，可以克服抗病品种对这些病害的抗性，从而很难培育优质、高产且具有光谱抗性的大麦和小麦品种。由于这类病害防治困难，已成为一类世界性重要病害。由中国小麦花叶病毒引起的小麦病害在冬小麦上发生严重。冬季叶片有轻微发紫症状。2月中、下旬气温回升，心叶上开始出现病斑。初始症状为从叶基部向叶尖方向发展的不连续、狭长的褪绿或黄化条纹，随叶片展开，呈不规则的褪绿花叶并逐渐变黄，后期整株黄化。2月下旬至3月上、中旬，麦苗外表症状最为明显，病苗植株矮小、分蘖少、根系发育不良、新生根少、褐色根多。进入5月以后，气温变高，花叶症状逐渐消失，新叶无症状。发病的植株严重矮化、枯萎，成熟后穂小粒瘪，发育不全，严重的甚至枯萎和死亡。中国小麦花叶病毒靠禾谷多黏菌传播, 具有持续土传的特性。禾谷多黏菌是Ledingham（1939）在加拿大的小麦上首次分离发现的, 并对该菌的形态学和生活史作了描述。禾谷多黏菌以游动孢子的形式侵染寄主, 该菌的休眠孢子在自然条件下可以长期存活, 适宜条件下能萌发产生游动孢子侵染寄主的根系, 同时所带病毒对寄主造成侵染。在农事活动中, 应杜绝传播途径, 控制病害的蔓延。建立无病留种田, 加强病害检疫, 严禁从病区调种, 不用病地土、病根茬等积肥, 发病土壤应采用土壤灭菌法杀菌, 作物实行轮作, 减少菌源积累, 最大程度地减少禾谷多黏菌侵染传病的有利条件。目前对于CWMV的防治还没有有效的防治药剂, 最有效的防治方法是选育抗CWMV的小麦品种, 优化栽培管理制度, 综合防治, 达到有效防控中国小麦花叶病毒病的目的。田间试验研究发现, 松散型小麦品种较直立紧凑型易感病。经研究工作者大量筛选鉴定, 已经确定Karl, Larned, Pandas, Hawk等4个品种对CWMV表现抗性，为我国CWMV抗病育种工作的开展提供了丰富的研究资源。在小麦的栽培管理中, 适期迟播, 避免麦苗冬前生长过旺造成冻害,降低植株的抵抗力。中耕除草, 加强肥水管理, 促进根系生长, 增强小麦植株的抗病能力。针对中国小麦花叶病毒(CWMV)单克隆抗体的制备展开工作。当前监测体系尚不完善，甚至主要流行区也未开展相关预测预报的工作。目前用来检测这种病毒的方法主要是田间观测、RT-PCR检测、电镜观察等方法。这几种方法都具有其局限性，而且不适合大批量的田间样品检测。而血清学的方法适于田间样品批量检测，但必须依赖于特异性的病毒单抗。以中国小麦花叶病毒(CWMV)提纯病毒粒子为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌抗CWMV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，以其分泌的单抗为核心建立了检测CWMV的高通量的血清学方法和检测试剂盒，并成功应用于田间中国小麦花叶病毒的检测，从而为我国中国小麦花叶病的早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗中国小麦花叶病毒(CWMV)单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。分泌抗中国小麦花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株18A3，能分泌抗中国小麦花叶病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株18A3于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏号为CGMCC No.9337；抗中国小麦花叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与中国小麦花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该单抗检测病叶的灵敏度达到1:40960倍稀释；抗中国小麦花叶病毒的单克隆抗体仅与中国小麦花叶病毒有特异性反应，而不与小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹病毒、水稻齿叶矮缩病毒反应、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、香蕉束顶病毒；抗中国小麦花叶病毒(CWMV)单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株分泌抗中国小麦花叶病毒(CWMV)特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA和TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测中国小麦花叶病毒；2）利用本专利技术所制备的单克隆抗体检测中国小麦花叶病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本专利技术所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物中的中国小麦花叶病毒的检测、诊断及该病毒病的预测预警和科学防控。附图说明图1 是dot-ELISA方法检测中国小麦花叶病毒的灵敏度分析；图2 是dot-ELISA方法检测田间小麦样品中中国小麦花叶病毒的结果。具体实施方式分泌抗中国小麦花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株18A3，能分泌抗中国小麦花叶病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株18A3于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9337；抗中国小麦花叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与中国小麦花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该单抗检测病叶的灵敏度达到1:40960倍稀释；抗中国小麦花叶病毒的单克隆抗体仅与中国小麦花叶病毒有特异性反应，而不与小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分泌抗中国小麦花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株18A3，其特征在于能分泌抗中国小麦花叶病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株18A3于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9337。

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗中国小麦花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株18A3，其特征在于能分泌抗中国小麦花叶病毒的特异性单克隆抗体, 杂交瘤细胞株18A3于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9337。
2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株18A3分泌的抗中国小麦花叶病毒的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体腹水ELISA效价达10-8，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与中国小麦花叶病毒的衣壳蛋白有特异性免疫结合反应，该单抗检测病叶的灵敏度达到1:40960倍稀释。
3.一种如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，周雪平，谢艳，刘欢，李娜，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33