小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一株小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株，小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株的制备方法及应用，本发明专利技术提供的细胞株不仅能在细胞培养条件下持续性传代，还具有潘氏细胞生理功能，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干细胞促生长因子。

【技术实现步骤摘要】
专利技术所属领域：本专利技术属于杂交瘤
，具体地说，本专利技术涉及小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株、制备小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株的方法及小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株的应用。技术背景潘氏细胞是许多动物消化道的一种细胞，近年来的研究表明：该细胞具有分泌动物特异性防御素、溶菌酶以及消化道干细胞生长因子等等物质的能力，其所分泌的这些物质能杀灭病原微生物和调控消化道细胞分化，对维持消化道的健康起着极其重大的作用（陶凯忠，唐庆娟，郑萍. 潘氏细胞研究进展，现代生物医学进展，2009，9 （4）：794-800）。目前，关于潘氏细胞的研究多采用组织学的方法，如免疫组化分析，分离培养潘氏细胞未见报道。用于实验研究的潘氏细胞系多为人或动物的癌变潘氏细胞，如T-84和Caco-2等（匡伟，赵国琦. 几种特殊的肠上皮细胞系. 中国畜牧杂志，2007，43（13）：41-43）。这类细胞系是通过长期体外培养驯化得来，往往不具备正常潘氏细胞的分泌功能（纪华英 ，陈其奎 ，曾 晖. 小鼠小肠上皮细胞的体外原代培养， 中国畜牧杂志，2010,16（9）：1417- 1419）；而从组织中分离的潘氏细胞又无法长期培养，这使得潘氏细胞的研究和利用受到很大限制。建立动物永生性细胞系通常采取传代细胞建系和癌变细胞建系的方法（薛庆善．体外培养的原理与技术．北京：科学出版社，2001）。这两种方法需要较长的时间或特殊的癌变组织。机体中一些高度分化的终末细胞如淋巴细胞等体外永续性培养非常困难，而建立的癌变细胞系与正常细胞具有本质区别，在研究中有很多局限性（马玉龙，许梓荣，郭 彤，等. 鸡肠上皮细胞的分离及原代培养方法. 中国兽医学报，2007,27（1）：74- 80.）。 专利技术
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株，该细胞株不仅能在细胞培养条件下持续性传代，还具有潘氏细胞生理功能，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干细胞促生长因子。本专利技术的再一个目的是提供一种制备小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株的方法。本专利技术的再一个目的是提供小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株的应用。本专利技术公开了一株新的杂交瘤细胞株，其特征在是：该细胞株由小鼠空肠的潘氏细胞与SP2/0细胞杂交融合而得，能在细胞培养条件下持续性传代，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干细胞促生长因子，该细胞是小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2014195，保藏日期是2014年10月24日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，是中国专利局指定的保藏机构， 位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，网址：www.cctcc.org , 电话：027-68752319，Email:cctcc@whu.edu.cn。在本专利技术公开后，不以赢利为目的的研究者可依法向保藏中心索取本微生物菌种再现本专利技术。本专利技术公开了小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株建立的方法，该方法包括如下步骤：（1）小鼠空肠消化道内膜细胞消化分离：将小鼠空肠取下后，用胰蛋白酶、中性蛋白酶和胶原酶的混合物进行消化，充分消化后用细胞培养液将消化离散的内膜细胞冲洗出来，配制成合适密度的细胞悬液；（2）细胞融合：细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0等量混合，用PEG作融合剂，常规方法融合，在用Raw264.7细胞制作的饲养细胞层上接种融合细胞，用HAT作筛选培养基，获得消化道内膜细胞杂交瘤细胞群；（3）杂交瘤细胞株的分离培养与筛选：用细吸管吸出不同的融合细胞克隆，分别培养于铺有Raw264.7饲养细胞层的培养孔中进行连续传代，平行样品进行荧光桃红染色，留下那些染色阳性的平行样品的细胞克隆继续培养，取平行样品进行CK-18抗体的潘氏细胞特异性抗原检测鉴定，选留具有潘氏细胞特异性抗原的融合细胞株作为潘氏细胞杂交瘤细胞株继续培养并保存，建成潘氏细胞杂交瘤细胞株。在本专利技术中，PEG指聚乙二醇，英文名polyethylene glycol的简称，HAT是含有H—Hypoxanthine次黄嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T——Thymidine 胸腺嘧啶核苷培养基的选择培养基。本专利技术中的潘氏细胞指小肠中的一类上皮细胞。本专利技术还公开了新的潘氏细胞杂交瘤细胞株的应用。 本专利技术中的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，Raw264.7饲养细胞可通过可通过市售商业生物公司或菌种保藏机构获得，如中国典型培养物保藏中心保藏有该细胞，研究者可向该中心索取。本专利技术的优点：于现有技术相比，本专利技术有如下优点：小鼠潘氏融合GCLP细胞株不仅能在细胞培养条件下持续性传代，还具有潘氏细胞生理功能，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干细胞促生长因子。本专利技术提供的细胞株克服了离体状态下难研究了潘氏细胞的情况，为长期的持续研究提供了大量的样本数。小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株为开发潘氏细胞分泌物的药物化功能以及由此开发出新型药物提供了生产资料基础。 附图说明图1是酶消化获得的小鼠空肠内膜细胞群荧光桃红染色图片图图2是盲杂交后获得的融合细胞克隆图图3是经筛选获得的潘氏融合细胞株荧光桃红染色图片图图4是潘氏融合细胞株核型分析图图5是潘氏融合细胞株潘氏细胞特异性抗原组织化学检测图  A表示潘氏融合细胞  B表示阴性细胞对照具体实施方式     下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应当理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不能限制本专利技术的保护范围。  实施例1  小鼠潘氏细胞杂交瘤细胞株的建立    1.1主要溶液与器皿的准备    1.1.1  含双抗的PBS溶液：在常规PBS溶液中加入青、链霉素，使其浓度分别达到200单位/ml和200mg/ml。    1.1.2  0.5%胰蛋白酶消化液：用加有0.04EDTA的PBS溶液配制胰蛋白酶溶液，使胰蛋白酶的终浓度为0.5%。    1.1.3  0.25%胰蛋白酶消化液：用加有0.02EDTA的PBS溶液配制胰蛋白酶溶液，使胰蛋白酶的中浓度为0.25%。    1.1.4  胶原蛋白酶+中性酶混合消化液：用无血清DMEM培养基分别配制胶原蛋白酶Ⅺ型及中性蛋白酶Ⅰ浓缩液，其浓度分别为2000u/ml和0.1mg/ml，用前将二者等量混合后，作10倍稀释。    1.1.5  DMEM完全培养基：向DMEM基础培养基中加入胎牛血清，使其终浓度达到15%。    1.1.6  其他常规培养用溶液    1.1.7  平端注射针头：16号注射针头尖端被锯平并打磨平滑，针管长度保持在2cm以上。    1.1.8  绑扎用线绳：消毒好的细棉线    1.1.9  动物实验用手术器械    1.1.10  平皿、离心管、吸管等其他分离细胞用器皿。1.1.11  所有溶液经0.2um过滤除菌、所有器皿经高温高压灭菌处理。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株杂交瘤细胞株，其特征在是：该细胞株由小鼠空肠的潘氏细胞与SP2/0细胞杂交融合而得，能在细胞培养条件下持续性传代，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干细胞促生长因子，该细胞是小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2014195。

【技术特征摘要】
1.一株杂交瘤细胞株，其特征在是：该细胞株由小鼠空肠的潘氏细胞与SP2/0细胞杂交融合而得，能在细胞培养条件下持续性传代，能分泌小鼠防御素、溶菌酶及消化道干细胞促生长因子，该细胞是小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C2014195。
2.制备权利要求书1中所述的小鼠潘氏细胞杂交瘤GCLP细胞株的方法，该方法包括如下步骤：
（1）小鼠空肠消化道内膜细胞消化分离：将小鼠空肠取下后，用胰蛋白酶、中性蛋白酶和胶原酶的混合物进行消化，充分消化后用细胞培养液将消化离散的内膜细胞冲洗出来，配制成合适密度的细胞悬液；
（2）细胞融合：细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞SP...

【专利技术属性】
技术研发人员：高其双，程百炼，卢顺，曹庭球，陈志华，周刚，彭霞，周莉，
申请(专利权)人：武汉市工程科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：湖北;42