黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽及其应用。本发明专利技术涉及药物领域，具体涉及抑制肿瘤血管生成，治疗恶性肿瘤的多肽。其序列为DNGVLVLLNVLETGVEEVKS是全新的序列，它们可以在体外特异性抑制肿瘤组织的血管内皮细胞的增殖和迁移，抑制肿瘤血管生成，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值；并可以作为检测试剂盒检测肿瘤的发生。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，具体涉及特异性抑制肿 瘤组织的血管内皮细胞的增殖和迀移，抑制肿瘤血管生成，治疗恶性肿瘤的多肽。
技术介绍
1971年Folkman提出肿瘤生长和转移依赖新生血管生成。并认为实体瘤形成后， 其发展可分为无血管期和血管期两个阶段。无血管期，微小肿瘤的存在依靠周围间质弥散 供血，生长速度呈线性，肿瘤限制在1mm~2mm之内，瘤细胞数少于105~10 6个，迫使肿瘤 处于"休眠状态";进入血管期后，肿瘤组织为灌注性供血，瘤体呈指数性生长，2周后可增大 1. 6万倍。新生血管不仅提供肿瘤所需要的营养和氧气，排除代谢产物，而且是远处转移的 途径。因此，阻断肿瘤新生血管形成就可能阻止肿瘤生长和转移，抗新生血管疗法也成为肿 瘤治疗的手段之一。 血管内皮与基质细胞黏附分子对肿瘤血管生成的作用越来越受到关注。黑色素瘤 细胞粘附分子（melanomacelladhesionmolecule，MCAM)是重要的细胞黏附蛋白，研宄报 道黑色素瘤细胞粘附分子是一个新的肿瘤血管标志分子，特异表达在肿瘤新生血管并参与 肿瘤血管生成。黑色素瘤细胞粘附分子具有膜受体的功能，参与VEGF调节血管生成过程。 研宄发现肿瘤分泌物中的某种因子能够诱导黑色素瘤细胞粘附分子二聚化，通过P38MAPK 信号通路活化NF-kB，上调多种促血管生成基因（VEGF、IL-8、ICAM-1、MMP9)的表达，从而 促进肿瘤血管的生成。动物实验表明，⑶146中和抗体AA98或⑶146siRNA都能够显著抑 制血管内皮细胞的增殖和迀移，以及多种肿瘤（肝癌、黑色素瘤、肉瘤）的生长和转移。因 此，抑制黑色素瘤细胞粘附分子可以有效抑制肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤生长，使肿瘤处 于"休眠状态"。目前，没有成熟开发的黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽问世，用于治疗恶性肿 瘤。 本专利中的黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽已证明在治疗黑色素瘤中有效，具 有在其他肿瘤模型中开发的前景。
技术实现思路
专利技术目的 本专利技术提供全新的序列，该序列为黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽，特异性抑 制肿瘤组织的血管内皮细胞的增殖和迀移，对恶性肿瘤具有很好的疗效。 技术方案 黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽，其特征在于其序列为 DNGVLVLLNVLETGVEEVKS〇 所述的黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。 一种检测黑色素瘤的试剂盒，其含有所述的黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽。 所述的试剂盒，其特征在于还有 (1)包被液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸盐缓冲液； (2)PBS缓冲液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸盐缓冲液；⑶抗体稀释液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS和 0? 2%BSA; (4)封闭液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸盐缓冲液和2. 0%BSA (5)洗涤液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05%Tween-20; (6)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液； (7)终止液：2mol/L硫酸溶液； (8)黑色素瘤细胞粘附分子抗体； (9)山羊抗小鼠IgG。 有益效果 利用固相合成法化学合成黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽，该多肽具有全新的 序列，该多肽可靶向识别肿瘤内皮细胞，并在体外抑制血管内皮细胞的增殖，治疗恶性肿 瘤，如黑色素瘤。我们发现的黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽可以同时抑制血管内皮细 胞迀移活力，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。并且可以作 为检测试剂盒检测肿瘤的发生。【具体实施方式】 本专利技术多肽DNGVLVLLNVLETGVEEVKS由上海生工合成。 实施例1 黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽人血管内皮细胞迀移的作用。 采用划痕实验。先用marker笔在24孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每 隔0. 5~lcm-道，横穿过孔。每孔穿过3条线；将成对数生长的HUVEC细胞，以1.OX105 加入24孔培养板中，培养24h。第二天用10y1枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，以 划痕和背后横线的交叉点为固定观察位点；实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的 实验药物黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽（上海生工合成）和阳性对照药物长春新碱； 空白组加入相同体积的溶剂，每孔设五个复孔；放入37°C、5%C02培养箱，培养。按0,6,12， 24，36小时，拍照；测量0，6，12，24，36h划痕宽度。以不同的时间点，记录每孔三个固定位置 处划痕宽度的变化，即为细胞迀移距离。按照公式计算迀移率（migrationrate，MR):迀移 率（MR)=(实验第n小时的划痕宽度一实验第0小时的划痕宽度）X100% /实验第0小时 的划痕宽度。结果，随黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽浓度增加，迀移抑制率逐渐下降， 说明黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽能够抑制人血管内皮细胞迀移，抑制率为73. 7%。 实施例2 黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽对体外培养人血管内皮细胞的生长和存活 IC50。 采用MTT比色法。将对数生长的人血管内皮细胞HUVEC，以1.OX105加入96孔培 养板中，培养24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物黑色素瘤细胞粘 附分子拮抗剂多肽（上海生工合成）和阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂。 每孔设五个复孔，培养48h，分别在Oh、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h每孔加入MTT，作用4h 后，加入DMSO,孵育30min，在酶标仪620nm处测定吸光度A值，按公式HUVEC生长抑制率= (1-实验组吸光值/对照组吸光值）X100%。计算出实验药物的IC50为13. 53yM。 实施例3 用肿瘤模型检测黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽的体内活力。 建立黑色素瘤肿瘤模型，阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂，实验 组多肽（上海生工合成）设3个剂量：0. 75、1.5、3mg/Kg。21天后，观察小鼠存活数量，计 算存活率。结果显示，黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽可有效地保护小白鼠，提高荷瘤小 鼠的生存率，生存率达到76. 35%。 实施例4含有黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽的ELISA试剂盒检测： 酶连免疫吸附实验（ELISA)试剂盒包括如下试剂： (1)包被液：0? 05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9. 6)。称取0? 75g碳酸钠，1. 46g碳酸氢 钠，加去离子水定容至500ml; (2)PBS缓冲液：0? 02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7. 4)。称取0? 2g磷酸二氢钾，2. 90g 磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml; (3)抗体稀释液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 2%BSA。称取 0? 2gBSA加入配好的 0. 02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至100ml; (4)封闭液：0?05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9. 6)和2.0%BSA。2.OgBSA加配好的 0. 05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml; (5)洗涤液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05 %Tween-20。将 50ulTwe本文档来自技高网...
【技术保护点】
黑色素瘤细胞粘附分子拮抗剂多肽，其特征在于其序列为DNGVLVLLNVLETGVEEVKS 。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：罗瑞雪，
申请(专利权)人：苏州普罗达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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