一种泰地罗新半抗原衍生物及其制备方法和检测试剂盒技术

本发明专利技术涉及免疫学领域，具体涉及一种泰地罗新半抗原衍生物及其制备方法和检测试剂盒，具体包括：首先采用三甲基氯硅烷(TMSCl)与泰地罗新反应得到C‑2’位‑OH TMS保护的泰地罗新，然后再与丁二酸酐反应使C‑3位‑OH酯化，最后脱保护得到C‑3位酯化产物，即泰地罗新半抗原衍生物，再与载体蛋白偶联完成完全抗原的合成，将泰地罗新完全抗原作为人工免疫原免疫小鼠得到血清，泰地罗新‑VOA完全抗原作为包被原，完成单克隆抗体的制备、亚克隆筛选、泰地罗新酶联免疫试剂盒的制备等。本试剂盒的主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。

A new semi antigen derivative of Thailand and its preparation method and detection kit

The present invention relates to the field of immunology, in particular to a Thailand new semi antigen derivative, a preparation method and a detection kit, in particular: first, three methyl chlorsilicane (TMSCl) is used to react with Thailand to a Thailand which is protected by the C 2 'OH TMS, and then reacts with the butylene anhydride to make C 3 OH esterified, Finally, the 3 esterification products of C, Thailand antigen, were obtained, and then the complete antigen was synthesized with the coupling of the carrier protein. The total antigen of Thailand was obtained as the serum of the Artificial Immunogen mice. The VOA complete antigen of Thailand was used as the primary antigen to prepare the monoclonal antibody and Ya Kelong. Screening and preparation of taelorus new ELISA kit. The main reagent of this kit is provided in the form of working fluid. The test method is convenient and convenient, with high specificity, high sensitivity, high accuracy and high accuracy.

【技术实现步骤摘要】
一种泰地罗新半抗原衍生物及其制备方法和检测试剂盒
本专利技术涉及免疫学领域，具体涉及一种泰地罗新半抗原衍生物及其制备方法和检测动物性食品中泰地罗新残留的酶联免疫检测试剂盒。
技术介绍
在兽药的免疫化学残留分析中，能否合成稳定的具有良好免疫原性的人工抗原是制备抗体和建立免疫分析方法的最关键步骤。目前国内外关于人工抗原的合成已做了大量的工作，有不少经验可以借鉴，但是由于免疫应答的复杂性和兽药结构的多样性。对于一个新的、具体的兽药待测物，其人工抗原的合成要根据结构特征，具体问题需具体对待。最理想的情况是设计、组合出多套方案，如在半抗原的设计中从不同位置引人不同性质、长度的连接臂，所合成的半抗原与多种载体相结合，采用不同的投料比，控制反应条件，最终得到不同性质、不同结合比的人工抗原，同时进行免疫试验，以达到优化筛选之目的。
技术实现思路
为了达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案来实现：泰地罗新的化学结构为：其在C-3，C-2’和C-4’位各有一个羟基，根据大环内酯化合物的结构特点，C-4’的羟基由于空间位阻活性最低，一般条件下很难反应，C-3位的羟基次之，C-2’位的羟基最活泼。一种泰地罗新半抗原衍生物，所述泰地罗新半抗原衍生物的化学式为C45H75N3O11，分子量为833.5241，其分子结构如下：本专利技术还提供了一种上述泰地罗新半抗原衍生物的制备方法，包括以下步骤：(1)将泰地罗新溶解于溶剂中，加入三甲基氯硅烷(TMSCl)和咪唑，在室温下搅拌反应后，水洗，保留有机相，干燥后蒸除溶剂；(2)将步骤(1)的产物溶于溶剂中，向其中加入丁二酸酐和吡啶，在室温下搅拌至反应完全；(3)将反应后的溶液水洗，保留有机相，干燥后，加入三氟乙酸脱保护，蒸干溶剂后得到泰地罗新半抗原衍生物。进一步的，步骤(1)中搅拌反应的时间为4h，步骤(1)中脱保护的时间为2h。进一步的，所述泰地罗新、三甲基氯硅烷、咪唑、丁二酸酐、吡啶的用量比为：1mmol:1-1.5mmol:10mg:(1.2-1.8)mmol:10mL；优选为1mmol:1.1mmol:10mg:1.5mmol:10mL。进一步的，所述溶剂为二氯甲烷，泰地罗新与步骤(1)、(2)中溶剂用量比为1mmol:10mL:10mL。本专利技术还提供了一种泰地罗新完全抗原的制备方法，将泰地罗新半抗原衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)加入溶剂中溶解，在室温下磁力搅拌反应过夜，再将其滴入载体蛋白溶液中，在室温下反应8h；反应完后，在4℃下用透析液透析3天，透析结束后离心，得到泰地罗新-载体蛋白完全抗原，即泰地罗新完全抗原，所述溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)和1,4二氧六环以体积比1:1配制而成。进一步的，所述泰地罗新半抗原衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二环己基碳酰亚胺的摩尔比为1:2:2。进一步的，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白(VOA)、血蓝蛋白或人血清白蛋白，进一步的，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。进一步的，所述载体蛋白溶液的浓度为0.04mmol/L。所述室温的温度范围为23℃±2℃。一种检测动物性食品中泰地罗新残留的酶联免疫检测试剂盒，包含包被有包被原的酶标板、酶标记抗体、泰地罗新单克隆抗体工作液、标准溶液、底物显色液A液、底物显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，其特征在于，所述包被原为泰地罗新-载体蛋白完全抗原，所述泰地罗新单克隆抗体工作液是由人工免疫原免疫小鼠得到的血清，其中人工免疫原是泰地罗新-载体蛋白完全抗原。所述底物显色液A液为过氧化脲溶液，底物显色液B液为四甲基联苯胺溶液终止液为2mol/L的硫酸溶液；浓缩洗涤液为含0.6％～1.0％(质量百分数)吐温-20和0.01％～0.02％(质量百分数)的叠氮化钠防腐剂的0.3～0.6mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲液；浓缩复溶液为pH值为7.4，含有9％～12％(质量百分数)卵清白蛋白、0.1～0.3mol/L的pH＝7.4的PBS缓冲液。进一步的，所述包被原为泰地罗新-VOA完全抗原，所述人工免疫原是泰地罗新-BSA完全抗原。与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果在于：首先采用三甲基氯硅烷(TMSCl)与泰地罗新反应得到C-2’位-OHTMS保护的泰地罗新，然后再与丁二酸酐反应使C-3位-OH酯化，最后脱保护得到C-3位酯化产物，即泰地罗新半抗原衍生物。本专利技术制备的泰地罗新半抗原能够最大程度的保持该药物分子的分子结构，能够制备出较好效价的单克隆抗体，并成功用于竞争ELISA试剂盒测试泰地罗新药物的浓度。附图说明图1为实施例一制备的泰地罗新半抗原衍生物的正离子质谱图；图2为实施例一制备的泰地罗新半抗原衍生物的负离子质谱图；图3为实施例二制备的泰地罗新-OVA、泰地罗新-BSA的抗原质控，Lane1:10uLMarker，从上到下依次为116、66.2、45、35、25、18.4、14.4KD；Lane2:10uL泰地罗新-OVA完全抗原；Lane3:10uL泰地罗新-BSA完全抗原；图4为实施例三中以5A9-1E9抗体为例绘制的标准曲线。具体实施方式下面结合附图和实施方式对本专利技术做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本专利技术的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本专利技术技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本专利技术的权利要求保护范围内。以下实施例中，未进行特别说明的试剂和方法均选用本领域内常用的试剂和方法。实施例一：泰地罗新半抗原衍生物的制备称取750mg泰地罗新溶解于10mL二氯甲烷中，然后加入1.1倍泰地罗新摩尔量当量的TMSCl和10mg咪唑，于25℃下搅拌反应4h，反应后的溶液经水洗，保留下层二氯甲烷有机相，将其用无水硫酸钠干燥后，蒸除溶剂二氯甲烷；将蒸除溶剂后的产物全部溶于10mL二氯甲烷中，再加入1.5倍泰地罗新摩尔量当量的丁二酸酐和10mL吡啶，在25℃下搅拌反应过夜，用薄层层析TLC监测，当反应原料反应完后，停止反应，反应后的溶液经少量水洗，保留下层二氯甲烷有机相，将其用无水硫酸钠干燥后，加入三氟乙酸脱保护2h，蒸干溶剂二氯甲烷后得到产物：泰地罗新半抗原衍生物。结果：得到产物为淡黄色，其质谱检测见图2和3，图2为泰地罗新半抗原衍生物的正离子质谱图，图3为泰地罗新半抗原衍生物的负离子质谱图，可以看出主要是泰地罗新与丁二酸酐成酯后的产物(分子量：正离子834，负离子832)，泰地罗新半抗原衍生物的化学式为C45H75N3O11，分子量为833.5241，其分子结构式为：实施例二：泰地罗新完全抗原的合成取10mg实施例1得到的泰地罗新半抗原衍生物(0.012mmol)、3mgN-羟基琥珀酰亚胺NHS(0.024mmol)和5mgDCC(0.024mmol)加入0.5mL溶剂中(DMF和1,4二氧六环按体积比1:1配制而成)溶解，在室温25℃下，磁力搅拌反应过夜，反应完后的溶液即为A液(A液中如有沉淀，则过滤取上清后再进行下一步操作)；取16mgBSA(0.0002mmol)，用5mL纯水溶解，为B液；将A液逐滴滴入B液中，然后在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种泰地罗新半抗原衍生物，其特征在于，所述泰地罗新半抗原衍生物的化学式为C45H75N3O11，分子量为833.5241，其分子结构如下：

【技术特征摘要】
1.一种泰地罗新半抗原衍生物，其特征在于，所述泰地罗新半抗原衍生物的化学式为C45H75N3O11，分子量为833.5241，其分子结构如下：2.一种权利要求1所述泰地罗新半抗原衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)将泰地罗新溶解于溶剂中，加入三甲基氯硅烷和咪唑，在室温下搅拌反应后，水洗，保留有机相，干燥后蒸除溶剂；(2)将步骤(1)的产物溶于溶剂中，向其中加入丁二酸酐和吡啶，在室温下搅拌至反应完全；(3)将反应后的溶液水洗，保留有机相，干燥后，加入三氟乙酸脱保护，蒸干溶剂后得到泰地罗新半抗原衍生物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述泰地罗新、三甲基氯硅烷、咪唑、丁二酸酐以及吡啶的用量比为：1mmol:1-1.5mmol:10mg:1.2-1.8mmol:10mL。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)、(2)中所述溶剂为二氯甲烷，泰地罗新与步骤(1)、(2)中溶剂用量比为1mmol:10mL:10mL。5.一种泰地罗新完全抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法步骤如下：将权利要求1所述的泰地罗新半抗原衍生物、N-羟基琥...

【专利技术属性】
技术研发人员：何斌，陈洁，刘武，姚艳丰，杨文海，邵志勇，吴利军，陈夏冰，金尔光，冉志平，陶弼菲，邓蓉蓉，周华，
申请(专利权)人：武汉市农业科学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42