一种泰乐菌素半抗原、人工抗原与抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种泰乐菌素半抗原、人工抗原与抗体及其制备方法和应用。具体是将泰勒菌素大环侧链的乙醛基官能团作为衍生偶联位点，通过一步氧化法将醛基转化为羧基，即得到羧甲基化偶联手臂的泰勒菌素半抗原。所得半抗原与骨架结构重叠度高，为泰乐菌素特征结构的暴露和高特异性抗体的产生做好了基础。进一步将半抗原与载体蛋白偶联得到人工抗原，并免疫动物获得泰勒菌素高特异性抗体，所建立的酶联免疫方法准确度高，灵敏度好，检测限达到0.051 ng/mL，半抑制浓度为1.39 ng/mL，且操作简单，成本低，非常适合于现场检测，可用于环境和食品样品中泰乐菌素的快速有效检测，具有广阔的应用前景和经济价值。

Tylosin hapten, artificial antigen and antibody, preparation method and application thereof

The invention discloses a tylosin hapten, artificial antigen and antibody, and a preparation method and application thereof. The glyoxylic functional group of the large ring side chain of the Taylor bacteria was used as a derivative coupling site, and the aldehyde group was converted to carboxyl group by one step oxidation method, that is, the Carboxymethylation of the Taylor bacteriocin hapten for the coupling of the arm. The overlap of the hapten and skeleton structure is high, which lays a foundation for the exposure of tylosin characteristic structure and the production of high specific antibodies. The artificial antigen was obtained by coupling the antigen with the carrier protein, and the high specific antibody of Taylor was obtained by immunizing animals. The established enzyme linked immunosorbent assay was of high accuracy, good sensitivity, the detection limit reached 0.051 ng/mL, and the semi inhibitory concentration was 1.39 ng/mL, and the operation was simple and the cost was low, so it was very suitable for field detection. It can be used for rapid and effective detection of tylosin in environmental and food samples. It has broad application prospects and economic value.

【技术实现步骤摘要】
一种泰乐菌素半抗原、人工抗原与抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于药物残留检测
更具体地，涉及一种泰乐菌素半抗原、人工抗原与抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
泰乐菌素(Tylosin,TYL)，亦称泰农，是Hamill等于1959年从弗氏链霉菌的培养液中获得的一种大环内酯类抗生素。TYL对革兰氏阳性菌有明显抑制效果，对部分革兰氏阴性菌也有抑制作用，对畜禽支原体疾病有很好的治疗作用，是治疗支原体疾病的首选药物。对绝大多数的螺旋体、病毒等具有一定的抑制及杀灭功效，还具有促进动物生长、改善饲料效率的作用，因此被广泛应用于畜牧养殖业中。但是这些药物的残留会引起人体的过敏反应(皮疹、过敏性休克等)，抑制肠道中正常的敏感菌群的生长，使致病菌、念珠菌大量增殖而导致全身或局部感染，并且发现耐泰乐菌素的肠球菌对红霉素具有抗性，其与一些其它抗生素的交叉耐药性会导致人体对抗生素产生抗药性，给临床治疗带来很大的危害。欧盟委员会于1999年禁止泰乐菌素作为增长促进剂使用。然而，在一些国家泰乐菌素还是作为家禽，猪和牛的生长促进剂被使用。为了人类健康的长远利益考虑，食品法典委员会，欧盟委员会和一些国家都建立了泰乐菌素在禽畜类食物中的最大残留限量。我国农业部在2002年发布的第235号文件《动物性食品中兽药最高残留量》对泰乐菌素也做出了最高残留限量标准。对于不同的物种及不同的组织其限量值不同，如在牛奶中限量为50μg/kg，在鸡蛋及猪肉、内脏等中的限量为200μg/kg。因此，研究和制定出能够简单、快速、灵敏、可靠地检测出食品中泰乐菌素残留的方法对完善我国食品安全监测体系具有重要意义。目前国内外有很多检测动物源性食品中泰乐菌素残留量的方法，主要包括微生物法、高效液相色谱、色谱－质谱联用法、免疫分析法(包括酶联免疫法和胶体金免疫层析)等。其中，微生物法因其分析周期长，实验步骤繁琐，灵敏度低等致命性的缺点逐渐被其他方法所替代。高效液相色谱法等仪器检测方法检测准确、灵敏度高、重复性好，但是仍然存在成本高，时间久，不能满足高通量，现场检测等问题。基于抗原抗体特异性反应的免疫检测方法现在已经较为成熟，与其他仪器方法比较，免疫分析方法灵敏度高，成本低，检测时间短，还适用于高通量样品的检测，已逐渐成为有毒有害残留物快速筛选监测的主要方法之一。目前，国内外使用酶联免疫方法检测泰乐菌素的技术大部分是利用带氨基的有机酸与泰乐菌素大环上的醛基反应得到带有羧基结构的衍生半抗原。这些半抗原结构较复杂，偶连手臂较长，容易折叠，造成骨架构象变化，不利于暴露于载体蛋白表面，免疫效果重复性不好，且对反应原料要求较高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有泰乐菌素残留检测技术的缺陷和不足，提供一种新的泰乐菌素半抗原结构，具体是将泰乐菌素分子大环内酯侧链的乙醛基直接一步氧化成羧基作为半抗原，而氧化后的乙酸手臂长短适中，不宜折叠，与骨架结构重叠度高，最大限度保持了泰勒菌素立体结构，有利于抗体的稳定免疫诱导，进而所述半抗原与载体蛋白偶联，其特异性结构突出于载体蛋白的表面，作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫系统，能获得特异性抗体，为建立免疫检测方法奠定基础。本专利技术的目的是提供一种泰乐菌素半抗原及其制备方法。本专利技术另一目的是提供一种泰乐菌素人工抗原及其制备方法。本专利技术再一目的是提供一种泰乐菌素抗体及其应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种泰乐菌素半抗原，其分子结构式如式(Ⅰ)所示：所述泰乐菌素半抗原在制备泰乐菌素人工抗原中的应用，也在本专利技术的保护范围之内。一种泰乐菌素人工抗原，是将上述泰乐菌素半抗原与载体蛋白偶联得到，其分子结构式如式(Ⅱ)所示：其中，所述载体蛋白为牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)。所述泰乐菌素半抗原或泰乐菌素人工抗原在制备泰乐菌素抗体(包括多克隆抗体)中的应用，也应在本专利技术的保护范围之内。一种酶联免疫检测泰乐菌素的免疫原和包被原组合，免疫原为所述半抗原与BSA偶联得到，包被原为所述半抗原与OVA偶联得到。所述免疫原和包被原组合在检测泰乐菌素或构建泰乐菌素酶联免疫检测方法中的应用，也应在本专利技术的保护范围之内。一种以上述泰乐菌素人工抗原为免疫原制备得到泰乐菌素抗体(包括多克隆抗体)，也应在本专利技术的保护范围之内。另外，本专利技术所述泰乐菌素半抗原的制备方法，是将泰乐菌素分子中大环内酯侧链特有醛基一步氧化成羧基得到泰乐菌素半抗原。具体地，所述泰乐菌素半抗原的制备方法具体包括如下步骤：(1)将酒石酸泰勒菌素溶于叔丁醇和水的混合液中，在0℃下依次加入NaH2PO4、二甲基亚砜、NaClO2，进行醛基氧化反应；(2)在反应液中加入乙酸乙酯和水萃取，收集有机相；水相再用乙酸乙酯萃取，收集得有机相；合并有机相用水和盐水洗涤，再用无水MgSO4干燥并过滤，滤液减压蒸除溶剂后，残留物经硅胶柱层析纯化获得白色固体，即为所述泰乐菌素半抗原。其中，优选地，步骤(1)所述叔丁醇和水的体积比为4～6：3。更优选地，步骤(1)所述叔丁醇和水的体积比为5：3。优选地，步骤(1)所述酒石酸泰勒菌素和NaH2PO4、NaClO2的摩尔比为1：3～5：1.5～2.5。更优选地，步骤(1)所述酒石酸泰勒菌素和NaH2PO4、NaClO2的摩尔比为1：4：2。另外，所述泰乐菌素人工抗原的制备方法，是采用活泼酯法将所述泰乐菌素半抗原和载体蛋白进行偶联，制备获得泰乐菌素人工抗原；具体包括如下步骤：(1)将权利要求1所述泰乐菌素半抗原溶于DMF中，然后加入DCC和NHS，于4℃下搅拌进行反应；(2)称取载体蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中，将上述步骤(1)的反应液离心，取出上清液逐滴加入到载体蛋白的磷酸盐缓冲溶液中，于4℃下继续反应；(3)将反应液于室温下透析3天，每天换2次透析液，即制得泰乐菌素人工抗原。其中，优选地，步骤(1)所述泰乐菌素半抗原与DCC和NHS的投料比为1：1.5～2.5：1.5～2.5。更优选地，步骤(1)所述泰乐菌素半抗原与DCC和NHS的投料比为1：2：2。优选地，载体蛋白与泰乐菌素半抗原的摩尔比为60：1。优选地，所述DMF和磷酸盐缓冲溶液的体积比为1：10。优选地，步骤(1)所述反应的时间为8～12h。优选地，步骤(2)所述反应的时间为8～12h。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术将泰勒菌素大环侧链的乙醛基官能团作为衍生偶联位点，通过一步氧化法将醛基转化为羧基，得到羧甲基化偶联手臂的泰勒菌素半抗原；而氧化后的乙酸手臂长短适中，不宜折叠，半抗原与泰勒菌素分子高度一致，与骨架结构重叠度高，其稳定构象与泰勒菌素分子稳定构象完全重叠，最大限度保持了泰勒菌素分子立体结构特征，有利于抗体的稳定免疫诱导，进而所述半抗原与载体蛋白偶联，其特异性结构突出于载体蛋白的表面，作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫系统，能获得特异性抗体，为建立免疫检测方法奠定基础。进一步采用活泼脂法将半抗原与载体蛋白偶联得到人工抗原，并通过人工抗原免疫动物获得泰勒菌素高特异性抗体，与其他结构及功能类似物均无交叉，进一步用所述抗原抗体优化建立了泰勒菌素酶联免疫吸附分析方法，检测限达到0.051ng/mL，半抑制浓度为1.39ng/mL，准确度和灵敏度很好，可用于环境和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种泰乐菌素半抗原，其特征在于，其分子结构式如式（Ⅰ）所示：

【技术特征摘要】
1.一种泰乐菌素半抗原，其特征在于，其分子结构式如式（Ⅰ）所示：。2.权利要求1所述泰乐菌素半抗原在制备泰乐菌素人工抗原中的应用。3.一种泰乐菌素人工抗原，其特征在于，是将权利要求1所述泰乐菌素半抗原与载体蛋白偶联得到，其分子结构式如式（Ⅱ）所示：。4.根据权利要求3所述的泰乐菌素人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清蛋白、卵清蛋白或匙孔血蓝蛋白。5.一种酶联免疫检测泰乐菌素的免疫原和包被原组合，其特征在于，免疫原为权利要求1所述半抗原与牛血清蛋白偶联得到，包被原为权利要求1所述半抗原与卵清蛋白偶联得到。6.权利要求1所述泰乐菌素半抗原或权利要求3所述泰乐菌素人工抗原在制备泰乐菌素抗体中的应用。7.权利要求5所述免疫原和包被原组合在检测泰乐菌素或构建泰乐菌素酶联免疫检测方法中的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉栋，姚婵媛，杨金易，王弘，徐振林，孙远明，韦晓群，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44