一种农杆菌介导的针刺生长点转化小麦方法技术

本发明专利技术公开了一种农杆菌介导的针刺生长点转化小麦方法，步骤包括：⑴将小麦种子培养至胚芽鞘长0.5‑1cm；⑵将含有目的基因的农杆菌用YEB培养液振荡培养；⑶用注射器针头蘸取准备好的农杆菌针刺茎尖生长点的位置；⑷将针刺后的小麦外植体在25℃黑暗培养2天；⑸然后将小麦农杆菌侵染后的外植体转入蛭石营养土中，在温室中培养。用本发明专利技术的方法可以快速获得转基因小麦株系，可以培育出各种抗逆的小麦新种质。 1

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的针刺生长点转化小麦方法
本专利技术涉及植物基因工程领域中一种培育转基因植物的方法及应用，涉及一种农杆菌介导的、针刺幼芽生长点转化小麦的方法。
技术介绍
小麦是最重要的粮食作物之一，全世界40％的人口以小麦为主食。2015年全球小麦的种植规模为2.24亿公顷，总产量为6.9亿吨。在我国北方，小麦是种植面积最大的粮食作物。各种生物逆境和非生物逆境是影响我国小麦的生产面临的重要威胁。小麦遗传转化困难等问题严重影响小麦功能基因组学的进展和研究。这些难题的解决有赖于小麦基因工程的进程。由于小麦的基因组巨大，遗传背景复杂，遗传转化困难，是三个重要的禾本科作物中最后一个获得转基因成功的。尽管从1992年以来利用基因枪法、花粉管通道法、农杆菌介导法、PEG法、电激法和激光微束法分别获得了转基因小麦，但其转化率都比较低。由于基因枪等物理转化法获得的转基因小麦存在外源基因的拷贝数多、再生困难和不育等缺陷，使小麦基因转化技术已成为限制小麦基因工程研究发展的重要因素。由于这种限制，至今获得的有经济价值的转基因小麦极其有限。与其他转化方法相比，农杆菌介导的小麦转化具有操作简单、培养周期较短等特点，更重要的是外源基因插入的拷贝性和完整性以及转基因植株可育植株比例高等优点。因此研究一套农杆菌介导的快速、高效小麦转化系统以突破小麦基因工程瓶颈具有重要的理论意义和巨大的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种农杆菌介导的小麦针刺茎尖转化方法，本方法不仅容易操作、费用低、高效率，能够显著提高植株的存活率，减少了外植体感染农杆菌污染的几率，而且不需要经过复杂的组织培养、能够得到大量的阳性后代等特点，具有很高的实际操作性及应用价值。本专利技术实现目的的技术方案如下：一种农杆菌介导的针刺生长点转化小麦的转基因方法，包括以下步骤：⑴将消毒后的小麦种子在湿润的培养皿中培养至胚芽鞘长0.5-1cm；⑵将含有目的基因的农杆菌用YEB培养液振荡培养，当菌液OD600浓度为0.5时，加入200μM乙酰丁香酮，培养至OD600浓度为0.6时备用；⑶用注射器针头蘸取准备好的农杆菌针刺茎尖生长点的位置；⑷将针刺后的小麦外植体在25℃黑暗培养2天；⑸然后将小麦农杆菌侵染后的外植体转入蛭石营养土中，在温室中培养。而且，所述步骤⑴中小麦种子消毒的方法为：用95％酒精洗2min，然后用20％次氯酸钠处理10min，无菌水冲洗3次。而且，所述农杆菌的YEB培养液配方为胰蛋白胨10g/L,酵母提取物10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl2g/L，农杆菌培养温度为28℃。而且，所述含有目的基因的农杆菌是含有插入表达载体后的重组质粒，优选农杆菌菌株为EHA105、GV3101或AGL1。而且，所述农杆菌的表达载体为植物表达载体，优选pCAMBIA系列载体。而且，所述遗传转化的外植体为小麦种子萌发后时得到的茎尖，胚芽鞘大概0.5-1cm，0.8cm。而且，步骤⑶所述的针刺生长点的位置的操作为：与胚芽鞘生长方向垂直，用5号注射器针头刺入生长点位置，操作前掰几个胚芽判断生长点的准确位置，大约1.5mm后迅速拔出。而且，所述注射器针头为5号针头。农杆菌介导的针刺生长点转化小麦的转基因方法在植物基因功能验证中的应用，所述植物为栽培或野生小麦品种、品系、或育种材料。本专利技术的优点和积极效果如下：本专利技术使用的注射器(5号针头)蘸取农杆菌，针刺茎尖生长点部位，由于注射器针头为中空，所以可以保留合适的农杆菌液体而又不会像传统浸泡所引起的农杆菌爆发带来的不利作用。本专利技术的方法与其他培育转基因小麦方法的显著区别在于采用注射器针刺小麦生长点，不仅注射器针头可以保留适量的农杆菌液体(毛细管作用)，而且机械损伤和化学诱导同时提高了小麦转化的阳性率。本专利技术农杆菌介导的遗传转化的外植体不是未成熟胚或胚性愈伤组织或悬浮细胞，不需要经过组织培养和植株再生的过程，从根本上克服了由于小麦基因型对转化后形成可育再生植株的限制。本专利技术通过对种子萌发早期的小麦生长点进行农杆菌介导的遗传转化，获得了报告基因表达的转基因小麦，成苗率平均95％，T1代幼苗报告基因表达阳性率占所检测植株的21％。尤为重要的是克服了小麦遗传转化的瓶颈问题-基因型的限制。附图说明图1为转基因小麦的GUS报告基因表达检测阳性率，转基因T0代所产生的T1代种子有25％的阳性转化植株。其中转基因株系的T1代的GUS染色检测。上两行为未转化小麦株系，下两行为成功转化的阳性株系。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。本专利技术所试材料的品种包括小麦材料新春10号、郑麦9023、京841、辽春10号，均获得上述效果。实施例1一种农杆菌介导的针刺生长点转化小麦方法，步骤如下，本实施例采用的事辽春10号。1、小麦外植体的处理将辽春10号小麦种子用95％酒精洗2min，然后用20％次氯酸钠处理10min，无菌水冲洗3次。把消过毒的小麦种子放入加有滤纸的湿润的培养皿中，25℃光照条件下萌发，得到待转化的小麦萌发种子(胚芽鞘大约长0.8cm)。本申请中：小麦种子萌发、培养及植株生长温度均为25℃，光照条件为16小时光照、8小时黑暗，栽入营养土之前均为无菌操作。2、转化农杆菌的培养将过夜培养的农杆菌菌株EHA105/pCAMBIA3301，其中含CaMV35S启动子驱动的GUS(β-葡萄糖苷酸酶)基因，2000rpm离心1分钟后弃上清，沉淀物用加有50㎎·L-1卡那霉素和50㎎·L-1利福平的液体YEP培养基重新悬浮，28℃，160rpm，培养至浓度在OD值到0.5后，加入200μmol·L-1乙酰丁香酮继续培养至OD值为0.6-0.8。所述农杆菌的YEB培养液配方为胰蛋白胨10g/L,酵母提取物10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl2g/L，农杆菌培养温度为28℃。3、转化用5号针头的注射器蘸取准备好的农杆菌，沿着胚芽鞘外侧垂直刺入步骤1所得的小麦茎尖生长点位置(大约1mm左右)，然后将侵染后的种子在25℃培养箱暗培养2天后，接着在25℃培养箱培养一周左右。备注：用5号注射器针头(与胚芽鞘生长方向垂直)刺入生长点位置(操作前可以掰几个胚芽判断生长点的准确位置)大约1.5mm后迅速拔出，不要刺入过深，过度损伤生长点。由于毛细管作用5号针头内含有侵染菌液，所以农杆菌可以顺利侵染。4、生长点转化后的培育和成苗待长出两到三片新叶子时移至育苗盆在自然光温室中(培养基成分：营养土：蛭石：草炭＝5：3：2)培养至正常结实。5、T1代种子的GUS筛选T1代种子萌发后，待长出第四片新叶时，用100mg/LBasta喷施叶片，一周后观察叶片发黄情况。检测目的基因的表达，目的基因表达阳性率占所检测植株的25％。Basta检测结果为阳性的植株再进行GUS染色确认。经鉴定所有分子检测阳性的植株都能被GUS染色。⑴GUS染色液配方(100ml)⑵x-gluc的配制：x-gluc先用少量DMSO完全溶解后，再加入染色液，最好现配现用。⑶染色将待处理的材料用解剖刀片切割待染色部位，放到新配制的GUS染色液中，真空渗透5min，37℃保温8小时。⑷脱色先用75％的酒精脱色，然后换成95％的酒精重复多次直本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种农杆菌介导的针刺生长点转化小麦的转基因方法，其特征在于：包括以下步骤：

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的针刺生长点转化小麦的转基因方法，其特征在于：包括以下步骤：⑴将消毒后的小麦种子在湿润的培养皿中培养至胚芽鞘长0.5-1cm；⑵将含有目的基因的农杆菌用YEB培养液振荡培养，当菌液OD600浓度为0.5时，加入200μM乙酰丁香酮，培养至OD600浓度为0.6时备用；⑶用注射器针头蘸取准备好的农杆菌针刺茎尖生长点的位置；⑷将针刺后的小麦外植体在25℃黑暗培养2天；⑸然后将小麦农杆菌侵染后的外植体转入蛭石营养土中，在温室中培养。2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的针刺生长点转化小麦的转基因方法，其特征在于：所述步骤⑴中小麦种子消毒的方法为：用95％酒精洗2min，然后用20％次氯酸钠处理10min，无菌水冲洗3次。3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的针刺生长点转化小麦的转基因方法，其特征在于：所述农杆菌的YEB培养液配方为胰蛋白胨10g/L,酵母提取物10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl2g/L，农杆菌培养温度为28℃。4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的针刺生长点转化小麦的转基因方法，其特征在于：所述含有目的基因的农杆菌是...

【专利技术属性】
技术研发人员：王翔，尹钧，尹飞，李磊，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41