一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用构建含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，属于基因工程领域。本发明专利技术以低油酸花生的△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B为标记基因，构建了一种含有△12‑脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体，实现了花生内源基因在遗传转化后代的快速筛选中的应用，该方法通过花生种子单粒近红外检测，可以在不损伤种子的条件下，快速、高效的筛选出转化体。本发明专利技术避免了利用抗生素筛选存在的假阳性、步骤繁琐和安全隐患等问题，而且转化效率高，操作简单，是一种安全、高效的筛选方法。

A method for screening transgenic peanut using expression vector containing Delta 12- fatty acid dehydrogenase gene

The invention relates to a method for screening transgenic peanuts by constructing an expression vector containing a delta 12 fatty acid dehydrogenase gene, belonging to the field of genetic engineering. In the present invention, a plant expression vector containing delta 12 fatty acid dehydrogenase gene AhFAD2B was constructed with the gene AhFAD2B of delta fatty acid dehydrogenase gene of low oleic acid peanut, which realized the application of peanut endogenous gene in the rapid screening of genetically transformed offspring. This method has passed the single kernel near infrared detection of peanut seeds. The transformants were screened quickly and efficiently without damaging the seeds. The invention avoids the problems of using antibiotics to screen false positive, tedious steps and hidden dangers of safety, and has high conversion efficiency and simple operation. It is a safe and efficient screening method.

【技术实现步骤摘要】
一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法
本专利技术涉及一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，属于基因工程领域。
技术介绍
花生是重要的油料作物，油酸和亚油酸是其油脂中的主要成分。研究发现，花生高油酸特性由2个主效基因控制，Jung等从普通花生及高油酸花生突变体(以SunOleic95R为父本杂交获得)中分离了这两个基因：AhFAD2A和AhFAD2B(JungS,SwiftD,SengokuE,PatelM,TeuleF,PowellG,MooreK,AbbottA.ThehigholeatetraitinthecultivatedpeanutArachishypogaeaL.I.Isolationandcharacterizationoftwogenesencodingmicrosomaloleoyl-PCdesaturases.MolGenGenet,2000,263:796-805.)。这两个基因均编码△12-脂肪酸脱氢酶，主要作用是催化油酸在碳12位去饱和产生亚油酸，是控制油酸和亚油酸含量的关键酶。在高油酸花生突变体F435中AhFAD2B442bp处有一单核苷酸“A”插入，其插入导致移码突变，从而产生无活性蛋白质；在AhFAD2A448bp处有单个核苷酸G到A的替换，结果是AhFAD2A编码的△12-脱氢酶活性降低。AhFAD2A和AhFAD2B同时突变可以产生高油酸表型，即油酸含量在70％以上，而单个基因的表达导致油酸含量降低到70％以下。在花生遗传转化过程中，利用抗生素类基因和抗除草剂类基因作为筛选标记基因进行筛选时，可能会对环境及人类健康产生不良影响和损害。因此，利用无争议的生物安全标记基因来构建表达载体，便逐渐成为新的研究热点。中国专利文献CN102433354A(申请号201110361128.7)公开了一种将木糖异构酶基因用于花生遗传转化的筛选方法，该方法从大肠杆菌中扩增获得木糖异构酶基因，构建重组表达载体，在以木糖为主要碳源的培养基上，转化体因能利用木糖而呈现优势生长，非转化体则因碳源供应不足而使生长受到抑制不能成苗。该方法是使用异源基因表达异源蛋白作为筛选标记。AhFAD2B基因为花生内源基因，其蛋白产物为△12-脂肪酸脱氢酶，催化油酸转化成亚油酸。亚油酸是一种ω-6必需脂肪酸，有抗血栓，保肝等功能。以高油酸花生为转化受体，将AhFAD2B基因作为筛选标记基因进行转化，转化后代可通过单粒近红外检测油酸含量的方法确定转化阳性株系。该方法不损伤种子，不影响样本的后续使用，操作非常简单，方便。因此，用AhFAD2B基因作为筛选标记基因是行之有效的方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法。本专利技术构建了含有AhFAD2B基因的植物表达载体pCAMBIA2300-AhFAD2B，并通过农杆菌介导的花萼管注射法转化花生，转基因阳性率达到13.5％。本专利技术避免了利用抗生素筛选存在的假阳性、步骤繁琐和安全隐患等问题，而且转化效率高，操作简单，是一种安全、高效的筛选方法。本专利技术的技术方案如下：△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B作为标签在筛选转基因花生中的应用，所述△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，包括以下步骤：(1)构建获得含有△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的植物表达载体，其中△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)将步骤(1)中含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体转入高油酸花生，通过单粒近红外技术检测转化后代种子的油酸含量；(3)当利用单粒近红外技术检测时，转化后代种子的油酸含量值≤65％，转化后代种子为转化成功的转基因花生。根据本专利技术优选的，上述步骤(1)中含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体的构建方法包括以下步骤：a、以AhFAD2A和AhFAD2B均未发生突变的普通油酸花生基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B，其中上游引物FAD2B-F的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，下游引物FAD2B-R的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；b、将步骤a中扩增的AhFAD2B基因连接到pMD18-T载体上，得到AhFAD2B-pMD18-T重组质粒；c、设计同源臂引物，扩增步骤b中AhFAD2B-pMD18-T重组质粒，获得含有同源臂的AhFAD2B基因，其中上游同源臂引物FAD2B-CZ-F的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，下游同源臂引物FAD2B-CZ-R的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；d、内切酶XhoI单酶切植物表达载体pCAMBIA2300-35s-ocs，将新霉素磷酸转移酶II基因NeoR切掉；e、利用同源重组的方法，将步骤c中含有同源臂的AhFAD2B基因与步骤d中酶切后的植物表达载体进行重组，获得含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体。根据本专利技术优选的，上述步骤a中普通油酸花生为丰花1号花生品种。根据本专利技术优选的，上述步骤a中PCR扩增的反应体系为：I-5Mix25μl，上游引物FAD2B-F和下游引物FAD2B-R各1μl，DNA模板1μl，H2O22μl；PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性20s，59℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸2min。根据本专利技术优选的，上述步骤b中得连接反应体系为：TopoMix1μl，007bluntVector1μl，步骤(1)PCR产物1μl，H2O7μl；室温下反应5min。根据本专利技术优选的，上述步骤c中扩增的反应体系为：I-5Mix25μl，上游同源臂引物FAD2B-CZ-F和下游同源臂引物FAD2B-CZ-R各1μl，AhFAD2B-pMD18-T模板1μl，H2O22μl；扩增反应程序为98℃预变性2min；98℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸2min。根据本专利技术优选的，上述步骤e中同源重组按照TreliefSoSooCloningKit试剂盒的说明书进行。一种重组菌株，其特征在于，含有上述重组的△12-脂肪酸脱氢酶基因植物表达载体的菌株。根据本专利技术优选的，所述菌株为农杆菌。有益效果：1.本专利技术以低油酸花生的△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B为标记基因，构建了一种含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体，实现了花生内源基因在遗传转化后代的快速筛选中的应用，该方法通过花生种子单粒近红外检测，可以在不损伤种子的条件下，快速、高效的筛选出转化体。2、本专利技术转化的受体花生品种为高油酸花生，其油酸含量高于70％，高油酸花生中AhFAD2A和AhFAD2B基因均突变，无法将油酸转化成亚油酸，而该载体中导入具有功能的AhFAD2B基因可以恢复△12-脂肪酸脱氢酶的功能，催化油酸到亚油酸的转化，降低转化后代的油酸含量至70％以下，所以当利用单粒近红外技术检测到转化后代的油酸含量在65％以下时，本文档来自技高网...

【技术保护点】
△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B作为标签在筛选转基因花生中的应用，所述△12‑脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B作为标签在筛选转基因花生中的应用，所述△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种利用构建含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达载体筛选转基因花生的方法，包括以下步骤：(1)构建获得含有△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的植物表达载体，其中△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)将步骤(1)中含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体转入高油酸花生，通过单粒近红外技术检测转化后代种子的油酸含量；(3)当转化后代种子的油酸含量值≤65％时，转化后代种子为转化成功的转基因花生。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中含有△12-脂肪酸脱氢酶基因的植物表达载体的构建方法包括以下步骤：a、以AhFAD2A和AhFAD2B均未发生突变的普通油酸花生基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得△12-脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B，其中上游引物FAD2B-F的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，下游引物FAD2B-R的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；b、将步骤a中扩增的AhFAD2B基因连接到pMD18-T载体上，得到AhFAD2B-pMD18-T重组质粒；c、设计同源臂引物，扩增步骤b中AhFAD2B-pMD18-T重组质粒，获得含有同源臂的AhFAD2B基因，其中上游同源臂引物FAD2B-CZ-F的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，下游同源臂引物FAD2B-CZ-R的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；d、内切酶XhoI单酶切植物表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵术珍，王兴军，石素华，厉广辉，孙金波，李膨呈，赵传志，夏晗，侯蕾，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东,37