一种幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒，该试剂盒包括：已包被抗幽门螺杆菌血清抗体的酶标板，抗幽门螺杆菌卵黄抗体。该试剂盒检测准确、灵敏度高。本发明专利技术还公开了一种幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒的制备方法及其检测方法，该制备方法简单，且制备的试剂盒重复性好，特异性高，操作简便，检测结果准确、快速。

【技术实现步骤摘要】
一种幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒及其制备方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
幽门螺杆菌(HelicobacterPylori，Hp)是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的革兰氏阴性杆菌。1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃粘膜活检组织中分离成功，是目前能够在人胃中生存的唯一微生物种类。幽门螺杆菌是全世界流行范围最广的病原体，大约有50％人感染了幽门螺杆菌，幽门螺杆菌的感染率与地区差异、及其经济条件和生活习惯息息相关：发达国家健康人群幽门螺杆菌的携带率一般在30％左右；发展中国家幽门螺杆菌的携带率一般在50％-70％之间；我国有40％-70％的人群感染幽门螺杆菌。幽门螺杆菌主要引起胃肠道消化系统相关疾病，给人民群众的健康造成了重大威胁，如慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌等，因此研究幽门螺杆菌的检测方法具有重要的临床意义。目前，幽门螺杆菌的检测方法主要有细菌学检测、尿毒酶检测、PCR检测、免疫学检测等。幽门螺杆菌在体外培养条件苛刻，不易培养，而且耗时较长，操作繁琐，费时费力，因此体外培养法在临床上的使用受到一定限制；尿毒酶检测方法操作简单、成本低廉，在临床上有一定使用价值；PCR检测具有灵敏度高、准确度高的特点，但容易污染，成本较高，且对环境和操作人员的要求比较高，临床应用具有局限性；免疫学检测主要通过抗原抗体反应进行检测，可以检测抗体，也可以检测抗原，灵敏度和特异性较高，有广阔的临床应用前景。综上所述，提供一种快速、高效、准确、灵敏地检测幽门螺杆菌的方法是十分必要的。专利技术内容鉴于上述现有技术存在的缺陷，本专利技术的目的是提供一种特异性强，灵敏度高，操作简便、检测快速的幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒。本专利技术的目的将通过以下技术方案得以实现：一种幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒，该试剂盒包括：已包被抗幽门螺杆菌血清抗体的酶标板，抗幽门螺杆菌卵黄抗体。进一步地，所述酶标板上包被的抗幽门螺杆菌血清抗体为兔抗幽门螺杆菌血清抗体，所述抗幽门螺杆菌卵黄抗体包括抗幽门螺杆菌卵黄抗体的活性片段、抗幽门螺杆菌卵黄抗体的保守性突变体、酶标抗幽门螺杆菌卵黄抗体、酶标抗幽门螺杆菌卵黄抗体的活性片段、酶标抗幽门螺杆菌卵黄抗体的保守性突变体中任一种或其组合。进一步地，还包括洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液。进一步地，所述酶标的标记酶为辣根过氧化物酶标记、碱性磷酸酶标记、丙酮酸激酶标记、葡萄糖氧化酶标记的任一种，或为荧光标记。本专利技术的另外一个目的是提供一种幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒的制备方法。该制备方法简单，且制备的试剂盒重复性好，特异性高。一种幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：1)采用50mM碳酸盐缓冲液包被抗幽门螺杆菌血清抗体，包被浓度4.8～5.2μg/mL，100-125μL/孔，4℃包被过夜，得包被抗幽门螺杆菌血清抗体的酶标板；2)甩去包被液，于吸水纸上扣干酶标板，加入封闭液230-280μL/孔，4℃封闭过夜，甩去封闭液，洗涤液洗板扣干，铝箔袋真空包装，得封装好的包被抗幽门螺杆菌血清抗体的酶标板；3)将抗幽门螺杆菌抗体单独封装，并与封装好的包被抗幽门螺杆菌血清抗体的酶标板一起放置包装盒中，即得。进一步地，上述步骤2)中所述封闭液选自浓度为1-5％的BSA。一种试剂盒检测幽门螺杆菌的检测方法，包括以下步骤：1)加入待测样品，100μL/孔，37℃孵育60min；2)甩去样品液，洗涤液洗板，加入1∶2000稀释的抗幽门螺杆菌抗体，100-125μL/孔，37℃孵育30min；3)加入显色液进行显色，100μL-120μL/孔，37℃反应15min；4)加入终止液终止反应，50-80μL/孔；5)酶标仪测定OD值，根据Cut-off值判断阴、阳性。与现有技术相比，本专利技术提供的幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒及其制备方法，达到的技术效果是：本专利技术选用抗幽门螺杆菌卵黄抗体和兔抗两种抗体，兔抗作为捕获抗体，卵黄抗体作为检测抗体，有效地排除非特异性的干扰，特异性强；而卵黄抗体作为检测抗体交叉反应少，显著的提高了灵敏度，使得双抗体夹心法检测试剂盒检测更加准确。附图说明图1为抗幽门螺杆菌卵黄抗体层析纯化图；图2为抗幽门螺杆菌卵黄抗体SDS-PAGE图；其中，图中1：Marker；2：BSA；3：抗幽门螺杆菌卵黄抗体(IgY)。以下便结合实施例及附图，对本专利技术的具体实施方式作进一步的详述，以使技术方案更易于理解、掌握。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术进行说明，但本专利技术并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，下面实施例并非用以限制本专利技术的专利范围，凡未脱离本专利技术所为的等效实施或变更，均应包含于本专利保护范围中。实施例1抗幽门螺杆菌卵黄抗体及其血清抗体(兔抗)的制备1、抗幽门螺杆菌卵黄抗体的制备1.1抗原的制备采用幽门螺杆菌标准株进行培养，收集菌液，离心收集沉淀，洗涤3次，得到幽门螺杆菌菌体，PBS缓冲液重悬，-20℃保存。1.2动物免疫选取6-8月龄刚开始产蛋的鸡种，采用幽门螺杆菌进行蛋鸡免疫，免疫程序如下：1.2.1首次免疫采用幽门螺杆菌与弗氏完全佐剂按体积比1∶1进行混合，充分乳化，免疫量100μg/只，翅下皮下注射；1.2.2间隔15天后进行第二次免疫，采用幽门螺杆菌与弗氏不完全佐剂按体积比1∶1混合，充分乳化，免疫量50μg/只，翅下皮下注射；1.2.3第二次免疫后第7天进行采血，采用ELISA间接法检测抗体效价并收集鸡蛋；1.2.4第二次免疫之后间隔15天采用不完全佐剂与抗原进行加强免疫，继续收集鸡蛋直到抗体效价开始下降至1∶256以下时，停止收集鸡蛋；其中，上述收集的鸡蛋均为含有抗幽门螺杆菌卵黄抗体的鸡蛋，该抗幽门螺杆菌卵黄抗体的效价为1∶256以上。1.3抗幽门螺杆菌卵黄抗体(IgY)提取与纯化(1)免疫球蛋白粗提：a.磷酸缓冲液配制(PBS)：20mMPB，150mMNaCl，pH7.4，0.45μm水膜真空过滤，2-8℃保存，备用；b.用水稀释法将实施例1第1.2节中制备的含有抗幽门螺杆菌抗体的鸡蛋取出卵黄，加2倍体积的PBS，漩涡震荡器上震荡10min，待混合均匀后置于滚动摇床上混合10min，然后置于高速冷冻离心机上进行离心，离心条件如下：4℃，13000r/min，20min。离心完成后弃沉淀，取上清液，2-8℃保存，备用；(2)初级沉淀：a.配制饱和硫酸铵溶液：室温(25±2℃)精确称取硫酸铵767g，加入纯化水1L，充分溶解后0.45μm水膜真空过滤，室温保存，备用；b.取免疫球蛋白的粗提液，加入饱和硫酸铵进行沉淀，操作步骤如下：i)于室温中将免疫球蛋白粗提液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，避免产生气泡；ii)按照免疫球蛋白粗提液体积的1/3的量取饱和硫酸铵缓慢匀速滴入，滴入时可以采用隔膜泵泵入进行滴加；iii)饱和硫酸铵滴加至2/3时溶液逐渐变浑浊，表明有蛋白沉淀生成，此时可以适当加快搅拌速度，但是同样要避免气泡产生；iv)饱和硫酸铵滴加完后将磁力搅拌器移入2-8℃冰箱中继续搅拌6-8h；v)高速冷冻离心：4℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：已包被抗幽门螺杆菌血清抗体的酶标板，抗幽门螺杆菌卵黄抗体。

【技术特征摘要】
1.一种幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：已包被抗幽门螺杆菌血清抗体的酶标板，抗幽门螺杆菌卵黄抗体。2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒，其特征在于，所述酶标板上包被的抗幽门螺杆菌血清抗体为兔抗幽门螺杆菌血清抗体，所述抗幽门螺杆菌卵黄抗体包括抗幽门螺杆菌卵黄抗体的活性片段、抗幽门螺杆菌卵黄抗体的保守性突变体、酶标抗幽门螺杆菌卵黄抗体、酶标抗幽门螺杆菌卵黄抗体的活性片段、酶标抗幽门螺杆菌卵黄抗体的保守性突变体中任一种或其组合。3.根据权利要求1或2所述的幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒，其特征在于，还包括洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液。4.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒，其特征在于，所述酶标的标记酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶、葡萄糖氧化酶的任一种，或是荧光标记。5.一种幽门螺杆菌双抗体夹心法检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)采用50mM碳酸盐缓冲液包被抗幽门螺杆菌血清抗体，包被浓度4....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘诚，毛慧慧，
申请(专利权)人：杭州雅盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33