高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法及系统技术方案

本发明专利技术公开了一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其包括：提供三维细胞培养芯片，其包括选定基底以及形成于选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由若干图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂组成；在所述芯片表面施加细胞悬浮液，再进行细胞培养，之后去除多余细胞，获得单细胞阵列；将基质胶施加到所述芯片表面，并将所述图纹结构完全覆盖，其后孵育至所述基质胶充分固化；以细胞培养完全培养基覆盖所述固化的基质胶，并持续培养，之后甄选阳性杂交瘤细胞进行后续处理。本发明专利技术还公开了一种相应的系统。本发明专利技术的方法操作简单，培养周期短，无需饲养细胞，且能大幅提高杂交瘤筛选通量，减小筛选结果的假阳性率。

【技术实现步骤摘要】
高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法及系统
本专利技术涉及一种生物芯片，特别涉及一种能够高通量快速筛选分泌单克隆抗体杂交瘤细胞的方法及系统。
技术介绍
自从科学家Kohler和Milstein于1975年创建单克隆抗体(McAb)技术以来，该技术不断发展完善，应用也日益广泛。能分离稳定高效分泌抗原特异性抗体的融合杂交瘤细胞是最终是否能纯化得到有效单克隆抗体的关键步骤。目前，杂交瘤细胞的筛选和克隆化方法有有限稀释法、流式细胞术筛选法、半固体培养法、微流控法以及微井法等。但这些方法各有缺陷。例如，有限稀释法的假阳性率高、耗时长、工作量大、操作繁琐且成本高；流式细胞术筛选法所需设备昂贵，成本较高，材料来源质量难以控制；半固体培养法中的杂交瘤细胞分布不均，降低了细胞筛选通量，细胞生长受限，克隆挑选困难及不易检测；微流控法的细胞污染可能性大，通量低；而微井法的成本高，过程中仅仅依靠重力作用，较难控制。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法及系统，以克服现有技术中的不足。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例提供了一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其包括：提供三维细胞培养芯片，所述芯片包括选定基底以及形成于所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；在所述三维细胞培养芯片表面施加细胞悬浮液，再置于细胞培养环境中进行细胞培养以使所述的各图案捕获单细胞，之后去除多余的细胞，获得单细胞阵列；将基质胶施加到所述三维细胞培养芯片的表面，并至少将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，其后置入细胞培养环境中孵育至所述基质胶充分固化；以细胞培养完全培养基覆盖所述固化的基质胶，并在细胞培养环境中持续培养，之后甄别和挑取阳性杂交瘤细胞并进行后续处理。进一步的，所述基质胶还包含能与所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体特异性结合的抗原。优选的，所述抗原上还修饰有用于指示有无所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体与所述抗原特异性结合的标记性物质。进一步的，所述选定基底表面上除所述图纹结构所在区域之外的其它区域具有排斥细胞的特性。进一步的，所述的后续处理包括：对挑取出的阳性杂交瘤细胞并进行单克隆培养或抗体轻重链基因扩增。本专利技术实施例还提供了一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的系统，其包括：三维细胞培养芯片，包括选定基底以及形成所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；基质胶，至少能够将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，并能在细胞培养环境中固化；以及，细胞培养完全培养基，至少能够完全覆盖固化的基质胶。本专利技术实施例还提供了一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的系统，其包括：印章及修饰剂，所述印章的印面具有设定立体结构，所述修饰剂能够以可脱离方式附着在所述印面上，且当在所述印章的印面上附着修饰剂后，并以所述印面接触选定基底表面时，至少部分修饰剂会脱离所述印面而附着在所述选定基底表面并形成图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；选定基底，用于与所述印章及修饰剂配合构建三维细胞培养芯片；基质胶，至少能够将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，并能在细胞培养环境中固化；以及，细胞培养完全培养基，至少能够完全覆盖固化的基质胶。进一步的，前述基质胶还包含能与所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体特异性结合的抗原。优选的，所述抗原上还修饰有用于指示有无所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体与所述抗原特异性结合的标记性物质，例如荧光探针。在一些实施方案中，前述三维细胞培养芯片的制备方法包括：采用软光刻技术制作具有设定图案结构的掩模；以液态高分子化合物或高分子化合物溶液均匀覆盖所述掩模，并形成具有设定厚度的液层；使所述液层固化，之后移除掩模，获得印章，所述印章的印面具有设定立体结构；以所述印章的印面与修饰剂接触，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；以所述印面与选定基底表面接触，之后将所述印章从选定基底上移离，从而在所述选定基底表面形成所述图纹结构，获得所述三维细胞培养芯片。进一步的，前述印章印面的设定立体结构由一个以上凸设于所述印章印面的突出部和/或一个以上凹设于所述所述印章印面的下凹部组成。进一步的，前述高分子化合物包括能够热固化和/或光固化的高分子化合物。优选的，前述高分子化合物包括高分子有机硅化合物，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，且不限于此。进一步的，前述修饰剂包括能够在选定基底表面修饰活性氨基的试剂，例如可以选用丙基多巴乙酰胺(PDAC)、对氨基马尿酸(PAH)、聚醚酰亚胺(PEI)或纤维连接蛋白(fibronectin)等，且不限于此。较之现有技术，本专利技术至少具有如下优点：(1)本专利技术提供的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法具有简单易操作、高通量、高可靠性、高稳定性等特点，例如，该方法在实施时，每个信号均由单个细胞形成，因此不需要反复克隆既能获得单纯的分泌抗原特异性抗体的细胞株，而且藉由该方法可以同时筛选通量达到105个杂交瘤细胞，能大幅提高筛选细胞获得率，同时筛选时间短，不需要细胞增殖，仅在单细胞层面就能获得阳性结果，还可有效避免因成纤维细胞生长而使杂交瘤细胞的生长受到抑制，此外还无需标记即可直接检测杂交瘤分泌的抗体，能同时鉴定出单个杂交瘤细胞分泌抗体的特异性和分泌强度。(2)本专利技术提供的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的系统成本低廉，只需一次投入，可以很长时间反复使用，且仍保持精确、高效的检测效果。附图说明图1是本专利技术一典型实施方案中一种PDMS印章的制备工作流程图；图2是本专利技术一典型实施方案中一种单细胞微阵列的形成过程示意图；图3是本专利技术一典型实施例中形成的一种单细胞微阵列的照片；图4是本专利技术一典型实施例中一种单细胞分泌的特异性单克隆抗体信号的荧光检测图。具体实施方式鉴于现有技术中的不足，本案专利技术人经长期研究和大量实践，得以提出本专利技术的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。本说明书涉及的一些技术术语的释义如下：光刻：是通过一系列生产步骤，将晶圆表面薄膜的特定部分除去的工艺。在此之后，晶圆表面会留下带有微图形结构的薄膜。通过光刻工艺过程，最终在晶圆上保留的是特征图形部分。软光刻：是涉及传统光刻、有机分子(例如硫醇和硅氧烷等)自组装、电化学、聚合物科学等领域的一类综合性技术的统称。杂交瘤细胞：杂交瘤细胞是在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B细胞融合而成的细胞。基质胶(Matrigel)：基质胶可认为是一种可溶性的基底膜基质。主要成分包括：层黏连蛋白、胶原IV等，同时含TGF-β成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子以及其它在EHS肿瘤中自然表达的生长因子等。单克隆抗体(Monoclonalantibody,McAb)：因单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定决定簇的特异性抗体。微流控技术(microfluidics)：指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的系统所涉及的科学和技术。又及，若非特别说明，则本说明书中述及的其它术语的含义均是本领域本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于包括：提供三维细胞培养芯片，所述芯片包括选定基底以及形成于所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；在所述三维细胞培养芯片表面施加细胞悬浮液，再置于细胞培养环境中进行细胞培养以使所述的各图案捕获单细胞，之后去除多余的细胞，获得单细胞阵列；将基质胶施加到所述三维细胞培养芯片的表面，并至少将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，其后置入细胞培养环境中孵育至所述基质胶充分固化；以细胞培养完全培养基覆盖所述固化的基质胶，并在细胞培养环境中持续培养，之后甄别和挑取阳性杂交瘤细胞并进行后续处理。

【技术特征摘要】
1.一种高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于包括：提供三维细胞培养芯片，所述芯片包括选定基底以及形成于所述选定基底表面的图纹结构，所述图纹结构包括由复数个图案形成的阵列，所述图案由至少能够促使单细胞附着的修饰剂形成；在所述三维细胞培养芯片表面施加细胞悬浮液，再置于细胞培养环境中进行细胞培养以使所述的各图案捕获单细胞，之后去除多余的细胞，获得单细胞阵列；将基质胶施加到所述三维细胞培养芯片的表面，并至少将所述选定基底表面的图纹结构完全覆盖，其后置入细胞培养环境中孵育至所述基质胶充分固化；以细胞培养完全培养基覆盖所述固化的基质胶，并在细胞培养环境中持续培养，之后甄别和挑取阳性杂交瘤细胞并进行后续处理。2.根据权利要求1所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所述基质胶还包含能与所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体特异性结合的抗原；优选的，所述抗原上还修饰有用于指示有无所述阳性杂交瘤细胞分泌的抗体与所述抗原特异性结合的标记性物质；优选的，所述标记性物质包括荧光探针。3.根据权利要求1所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养芯片的制备方法包括：采用软光刻技术制作具有设定图案结构的掩模；以液态高分子化合物或高分子化合物溶液均匀覆盖所述掩模，并形成具有设定厚度的液层；使所述液层固化，之后移除掩模，获得印章，所述印章的印面具有设定立体结构；以所述印章的印面与修饰剂接触，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；以所述印面与选定基底表面接触，之后将所述印章从选定基底上移离，从而使至少部分修饰剂脱离所述印面而附着在所述选定基底表面并形成所述图纹结构，获得所述三维细胞培养芯片。4.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养芯片的制备方法具体包括：在基片上涂覆一层光刻胶，之后烘烤、曝光，并再次烘烤，其后显影，制得所述掩模；和/或，所述掩模的厚度为7～15μm。5.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所述印章印面的设定立体结构由一个以上凸设于所述印章印面的突出部和/或一个以上凹设于所述所述印章印面的下凹部组成。6.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养芯片的制备方法包括：至少将所述印章的印面完全浸渍于液态的修饰剂或修饰剂溶液中，之后取出，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上；优选的，所述三维细胞培养芯片的制备方法包括：在室温条件下，将所述印章的印面完全浸渍于液态的修饰剂或修饰剂溶液中，保持10min以上，之后取出，洗涤、干燥，使所述修饰剂以可脱离方式附着在所述印面上。7.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所述高分子化合物包括能够热固化和/或光固化的高分子化合物；优选的，所述高分子化合物包括高分子有机硅化合物；优选的，所述高分子化合物包括聚二甲基硅氧烷。8.根据权利要求1所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所述图纹结构中，任一图案的面积由所需的吸附细胞面积决定，而任意两个相邻图案的距离由所需的相邻细胞的间距决定；优选的，相邻图案之间的间距在30μm以上，尤其优选为30μm～100μm；优选的，所述图案用以吸附细胞的面积为5μm×5μm～15μm×15μm；和/或，所述图纹结构的厚度为7～15μm；和/或，所述选定基底表面上除所述图纹结构所在区域之外的其它区域具有排斥细胞的特性。9.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养芯片的制备方法包括：先对所述选定基底进行表面处理，以至少使所述选定基底表面具有排斥细胞的特性，之后将所述印面与选定基底表面接触，从而在所述选定基底表面形成所述图纹结构；优选的，所述表面处理包括等离子体处理或者化学修饰处理；优选的，所述化学修饰处理用的试剂包括聚苯乙烯磺酸钠或硅烷化的聚乙二醇。10.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于，所述三维细胞培养芯片的制备方法包括：将印面附着有修饰剂的印章一次性放置在所述选定基底上，使所述印面与选定基底表面在设定压力下接触并保持30s以上，然后移除所述印章，从而在所述选定基底表面形成所述的图纹结构。11.根据权利要求3所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞的方法，其特征在于：所述修饰剂包括能够在选定基底表面修饰活性氨基的试剂；优选的，所述修饰剂包括丙基多巴乙酰胺、对氨基马尿酸、聚醚酰亚胺或纤维连接蛋白。12.根据权利要求1所述的高通量快速筛选阳性杂交瘤细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：索广力，乔勇，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32