特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体的制备方法及其应用试剂盒技术

本发明专利技术属于枣疯植原体检测领域，尤其涉及特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体的制备方法及其应用试剂盒。本发明专利技术所提供的特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体主要应用于枣疯病的检测，其制备方法包括以下有效步骤：a、从感染枣疯植原体的枣树总DNA中克隆获得枣疯植原体的免疫膜蛋白基因序列，预测免疫膜蛋白的氨基酸序列，选取C端表位暴漏性较好的47‑152aa区域进行蛋白表达，进行标签纯化；b、标签纯化后，将选取的蛋白与不完全弗氏佐剂混合免疫大耳白兔，采集兔子血液，经抗原亲和纯化获得枣疯植原体免疫膜蛋白的多克隆抗体。本发明专利技术所提供的特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体在枣疯病的检测中，具有显著的特异性，确保了检测的准确性。

【技术实现步骤摘要】
特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体的制备方法及其应用试剂盒
本专利技术属于枣疯植原体检测领域，尤其涉及特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体的制备方法及其应用试剂盒。
技术介绍
枣树原产于我国，其栽培品种和野生酸枣资源极为丰富，是我国具有重要经济价值的特色果树树种之一。枣疯病是我国枣树上最严重的病害，也是世界上典型的植原体病害之一，其病原为枣疯植原体，属于榆树黄化16SrV-B亚组。植原体是一类无细胞壁、存在于植物筛管内的病原细菌，主要依靠叶蝉等从韧皮部取食的半翅目昆虫传播，也可由菟丝子和嫁接等传播，因此，植原体膜蛋白可能直接与昆虫或者植物细胞质的某些组分互作，免疫主导膜蛋白是植原体膜蛋白中的重要组分之一。植原体免疫主导膜蛋白承受着较大的选择压力，研究植原体免疫主导膜蛋白的多样性及功能，为进一步阐明植原体致病机制、抗病性鉴定及病害防治奠定基础。由于枣疯植原体不能离体培养，因而不能采用研究真菌、细菌的传统研究方法进行检测和鉴定。目前，枣疯植原体的检测主要依靠生物学测定(嫁接、症状类型等)、电镜观察、PCR检测技术。传统的症状观察依赖枣树枝叶的症状表现，主要依赖经验诊断，并无具体诊断数据支撑，仅能作为枣疯病植原体鉴定的形态学指标，而不能作为病原检测的主要方法；嫁接检测所需的等待时间过长，待检测结果确定，病害或已发病至中后期，不适用于大田生产的早期快速检测；电镜检查需要对感病组织做超薄切片、专业度高，并且依赖昂贵的电子显微镜检测，无法在农业生产实践中普及；PCR检测技术是一种基于核酸水平的检测技术，设计通用引物和特异性引物，通过PCR扩增检测植原体存在与否，具有较高的准确性和灵敏性，在学术研究、科研院所的实际检测方面起着重要作用，但专业度太高、操作复杂，成本高，检测结果容易受植物组织提取液的影响，假阳性或假阴性结果现象时有发生，另外，PCR技术操作过程繁琐、耗时长，完全依赖于PCR仪器和商业化的试剂，不适于田间的大规模病害检测。枣树感病后结果量减少，品质下降，通常2-3年内病树丧失产量并全株死亡。枣疯病几乎分布于国内主要枣树栽培区，每年造成死树高达千万株，直接经济损失达数亿元，已严重阻碍我国枣树产业的可持续发展。因此，我们亟需建立一种操作简单、成本低廉的枣疯植原体高效检测方法，方便工作人员田间病害调查快速检测，尤其是便于广大枣农或非专业人士快捷、易操作地发现病原、防止病害传播，保障农业生产的正常进行。因此，我们亟需建立一种操作简单、成本低廉的枣疯植原体高效检测方法，方便工作人员田间病害调查快速检测，尤其是便于广大枣农或非专业人士快捷、易操作地发现病原、防止病害传播，保障农业生产的正常进行。
技术实现思路
本专利技术针对上述的枣疯病检测流程繁琐、检测成本高、检测技术难度大等技术问题，提出一种设计合理、方法简单、操作方便且无需专业知识即可检测出枣疯病的特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体制备方法及其应用试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为，本专利技术首次克隆到枣疯植原体免疫膜蛋白基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还提供一种基于上述枣疯植原体免疫膜蛋白基因所制备的用于检测枣疯病的特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体，其制备方法包括以下有效步骤：a、从感染枣疯植原体的枣树总DNA中克隆获得枣疯植原体的免疫膜蛋白基因序列，预测免疫膜蛋白的氨基酸序列，选取C端表位暴漏性较好的47-152aa区域进行蛋白表达，进行标签纯化；b、标签纯化后，将选取的蛋白与不完全弗氏佐剂混合免疫大耳白兔，采集兔子血液，经抗原亲和纯化获得枣疯植原体免疫膜蛋白的多克隆抗体。为了使特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体能够实现操作简单化，通俗化，本专利技术还提供了特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体的应用试剂盒，该试剂盒包括以下有效成分：本专利技术还提供了上述特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体的应用试剂盒的应用方法，包括以下有效步骤：A.样品处理：将疑似病样按照1:10或1:100的比例加入抗原包被缓冲液，研磨后取上清备用；B.样品包被：取150μL稀释的检测样品液加入96孔酶标板中，以枣疯植原体阳性标准品为阳性对照，以健康枣树标准品为阴性对照，在4℃条件下孵育过夜或37℃孵育1-2h；C.洗板：将酶联板迅速反扣，弃去孔中液体，每孔加入PBST液200μL，静置3-5min后迅速弃去孔中液体，并在吸水纸上扣打几下以尽量除去孔中液体，重复3次；D.封闭：去除酶标板中的PBST缓冲液，每孔加入150μL的封闭缓冲液，37℃恒温箱孵育1.5h；E.洗板：同步骤C；F.加一抗：用PBST稀释枣疯植原体免疫膜蛋白抗体(来源于兔)至合适的工作浓度(1:1000)，每孔样品加150μL，37℃恒温箱孵育2h；G.洗板：同步骤C；H.加酶标抗体：每孔加入150μLPBST稀释的碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔(1:5000)，37℃恒温箱孵育2h；I.洗板：同步骤C；J.底物显色：每孔加底物溶液150μL；室温避光显色30-60min；酶联仪在405nm下读数。K.结果判定：I/H＝(待测样品读数－空白读数)/(阴性样品的读数－空白读数)≥3判断为阳性反应；反之则为阴性。作为优选，所述A步骤中，疑似病样经研磨装置处理1min，8000rpm离心5min，取上清液用包被缓冲液稀释2倍备用。作为优选，所述A步骤中，将疑似病样用研磨棒研磨至样品呈糊状，静置15min，取上清液用抗原包被缓冲液稀释2倍备用。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于，1、本专利技术通过提供一种特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体并使其应用在试剂盒中，进而使无专业技术人员也可以及时排查枣疯病病树病枝，并将其及时销毁、防止枣疯病传播，确保不发生重大枣生产质量安全，巩固当前农业农村经济形势，保障农民、保产、增产、增收。2、本专利技术所提供的特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体在枣疯病的检测中，具有显著的特异性，进而避免了传统检测方法中极易出现的假阴性或假阳性的结果，确保了检测的准确性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1感染枣疯植原体不同枣树组织样品Westernblotting检测结果示意图，其中，M为低分子量蛋白Marker；1为感病枣树的嫩叶组织检测结果；2为感病枣树的叶中脉组织检测结果；3，感病枣树的嫩枝组织检测结果；4，感病枣树的树皮韧皮部组织检测结果；5，感病枣树的根组织检测结果；6为健康枣树的嫩叶组织检测结果；图2感病样品进行1K-512K不同比例稀释的试剂盒检测酶联板反应结示意图，其中，1为水作为空白对照组；2为健康枣树叶组织研磨上清液稀释1K倍作为阴性对照组；3为健康枣树叶组织研磨上清液稀释4K倍作为阴性对照组；4-12为感病枣树叶组织研磨上清液稀释1K-521K倍检测结果示意图；具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的上述目的、特征和优点，下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。在下面的描本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枣疯植原体的免疫膜蛋白基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种枣疯植原体的免疫膜蛋白基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下有效步骤：a、从感染枣疯植原体的枣树总DNA中克隆获得枣疯植原体的免疫膜蛋白基因序列，预测免疫膜蛋白的氨基酸序列，选取C端表位暴漏性较好的47-152aa区域进行蛋白表达，进行标签纯化；b、标签纯化后，将选取的蛋白与不完全弗氏佐剂混合免疫大耳白兔，采集兔子血液，经抗原亲和纯化获得枣疯植原体免疫膜蛋白的多克隆抗体。3.上述权利2所述的特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体的应用试剂盒，其特征在于，包括以下有效成分：4.上述权利要求3所述的特异性识别枣疯植原体的兔抗多克隆抗体的应用试剂盒的应用方法，其特征在于，包括以下有效步骤：A.样品处理：将疑似病样按照1:10的比例加入抗原包被缓冲液，研磨后取上清备用；B.样品包被：取150μL稀释的检测样品液加入96孔酶标板中，以枣疯植原体阳性标准品为阳性对照，以健康枣树标准品为阴性对照，在4℃条件下孵育过夜或37℃孵育1-2h；C.洗板：将酶联板迅速反扣，弃去孔中液体，每孔加入PBST液200μL，静置3-5min后迅速弃去孔中液体，并在吸水纸上扣打几下以尽量除去孔中液体，重复...

【专利技术属性】
技术研发人员：高瑞，王洁，杨淑珂，李凡，路兴波，
申请(专利权)人：山东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37